DiD?perchlorate?是一種發(fā)出遠(yuǎn)紅色熒光的親脂性羰花青，廣泛用作親脂性示蹤劑。 它在水中發(fā)出弱熒光，但當(dāng)摻入膜中時(shí)發(fā)出強(qiáng)熒光。 它在脂質(zhì)環(huán)境中具有極高的消光系數(shù)和短的激發(fā)態(tài)壽命（~1 納秒）。 一旦應(yīng)用于細(xì)胞，染料就會在質(zhì)膜內(nèi)橫向擴(kuò)散。

圖1.DiD?perchlorate化學(xué)結(jié)構(gòu)

DiD操作說明（僅供參考）?
1.染色液制備
（1）儲存液制備：用 DMSO或EtOH配置濃度1～5 mM。
【注】未使用的儲存液分裝儲存在-20℃，避免反復(fù)凍融。
（2）工作液制備：用合適的緩沖液稀釋儲存液，配制濃度為1～5 μM的工作液。
【注】工作液濃度根據(jù)不同細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)體系來優(yōu)化。建議從推薦濃度的10倍范圍內(nèi)開始最優(yōu)濃度的摸索。
2.懸浮細(xì)胞染色
（1）加入適當(dāng)體積的染色工作液重懸細(xì)胞，使其密度為1×106/mL。
（2）37 ℃孵育細(xì)胞 2～20min，（不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同?？梢?0min作為起始孵育時(shí)間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記結(jié)果）

（3）孵育結(jié)束后，1000～1500 rpm離心5min。
（4）傾倒上清液，再次緩慢加入37℃預(yù)熱的生長培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
（5）重復(fù)（3），（4）步驟兩次以上。
3.?貼壁細(xì)胞的染色
（1）將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。
（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。
（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。
（4）37 ℃孵育細(xì)胞 2～20min，（不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同?？梢?0min作為起始孵育時(shí)間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記結(jié)果）

（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，孵育5～10min，然后吸干培養(yǎng)基。

圖2.DiD?perchlorate染色細(xì)胞