摘要：Monolith分子互作儀檢測超大復(fù)合物蛋白酶體26S與去泛素化酶USP14之間相互作用。

4月27日，北京大學(xué)毛有東教授團(tuán)隊(duì)在Nature雜志在線發(fā)表了文章“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”。通過時(shí)間分辨冷凍電鏡技術(shù)，揭示了與去泛素化酶動(dòng)態(tài)調(diào)控人源蛋白酶體（proteasome）的機(jī)制。

背景

在真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)降解是一項(xiàng)極其重要的生物化學(xué)過程，對細(xì)胞周期及分子功能都發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。泛素-蛋白酶體系是蛋白質(zhì)降解的一種主要方式。據(jù)報(bào)道，蛋白酶體功能紊亂，與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、免疫疾病等一系列人類疾病有關(guān)。

去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶體調(diào)控分子，因此它被認(rèn)為是一個(gè)潛力巨大的癌癥和神經(jīng)退行性疾病的靶標(biāo)。USP14通過可逆結(jié)合蛋白酶體26S被激活，剪切底物上的泛素鏈，然而這一過程速度極快，時(shí)間尺度在毫秒到秒之間。因此USP14被蛋白酶體激活并調(diào)控蛋白酶體功能的機(jī)制，一直是個(gè)世界級(jí)的科研目標(biāo)。

研究方法及結(jié)果

為了闡明USP14與蛋白酶體26S之間的調(diào)控機(jī)制，毛有東研究團(tuán)隊(duì)通過大量的條件摸索，優(yōu)化出一套時(shí)間分辨冷凍電鏡技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方案。最終獲得了含時(shí)的45,193張USP14-26S復(fù)合體降解泛素底物過程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了超過300萬個(gè)USP14-26S-泛素底物復(fù)合體的顆粒圖像。

接下來，研究團(tuán)隊(duì)利用自主開發(fā)的人工智能高精度三維分類四維重建技術(shù)，捕獲了USP14-26S復(fù)合體降解多泛素化底物過程的13種不同功能中間狀態(tài)的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡構(gòu)象，通過時(shí)間分辨冷凍電鏡分析，重建了受控蛋白酶體的完整動(dòng)力學(xué)工作周期。

在闡述USP14被蛋白酶體26S激活的機(jī)制的過程中，研究團(tuán)隊(duì)利用Monolith分子互作儀檢測了有底物和無底物的條件下，蛋白酶體26S與USP14的相互作用。結(jié)果表明，蛋白酶體與全長USP14在底物Ubn-Sic1PY存在下時(shí)，解離常數(shù)為43.9 nM（圖2 o），是無底物存在時(shí)（圖2 l）的一半。蛋白酶體與UBL結(jié)構(gòu)域 (圖2 m)或 USP結(jié)構(gòu)域（圖2 n）的親和力更低，解離常數(shù)分別為137 nM和 135 nM。由此驗(yàn)證了蛋白酶體與USP14及其UBL和USP結(jié)構(gòu)域的相互作用，并且在底物存在時(shí)，親和力增強(qiáng)。

結(jié)論

這項(xiàng)突破性的研究闡明了USP14和26S相互調(diào)控活性的原子級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和非平衡動(dòng)力學(xué)機(jī)制，為USP14靶向藥物分子的開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

《Nature》同期發(fā)表的專欄推介文章中，審稿人評(píng)價(jià)?"該工作是一項(xiàng)重大研究，終于在原子水平解決了USP14活化和其調(diào)控蛋白酶體功能的機(jī)制問題"?。

Monolith在本項(xiàng)研究中突顯的優(yōu)勢

• ????檢測大分子vs超大復(fù)合物 (USP14 ~65kDa，蛋白酶體26S ~3000 kDa)

• ????溶液體系中輕松檢測三元互作，驗(yàn)證了底物對于USP14-proteasome親和力的影響

• ????精確檢測nM級(jí)解離常數(shù)，用于比較USP14不同結(jié)構(gòu)域和蛋白酶體26S的親和力大小

• ????儀器操作簡單，無需繁瑣的清洗維護(hù)