設(shè)計一個完整的RNAi實驗涉及許多重要參數(shù)，包括基因靶標(biāo)的類型和數(shù)量、細(xì)胞系的選擇和siRNA傳遞的方法、下游檢測、適當(dāng)?shù)膶φ?、分析的時間點，以及數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計方法。

那么你知道如何設(shè)置RNAi的對照嘛？

①?陽性和轉(zhuǎn)染對照siRNA

一個已知陽性對照siRNA可以提供其靶mRNA的敲低。使用陽性對照目的是確定轉(zhuǎn)染和沉默的實驗設(shè)置是最佳的。siRNA常用的陽性對照MAPK1、Lamin A/C、Beta-Actin、?P53、?GAPDH等。

另外，可誘導(dǎo)檢測表型的siRNA，如AllStars Cell Death Control siRNAs，也可以用于這一目的。它是一種高效 siRNA 的混合物，靶向普遍表達(dá)的人類基因，這些基因?qū)?xì)胞存活至關(guān)重要。 這些基因的敲除會誘導(dǎo)高度的細(xì)胞死亡，這在光學(xué)顯微鏡下是可見的。 在轉(zhuǎn)染 AllStars?Cell Death Control siRNA 后 48-96 小時，通過簡單的光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞，即可快速估計轉(zhuǎn)染效率，無需任何復(fù)雜或費(fèi)力的下游檢測。

②?陰性對照

陰性對照siRNA通常是一種與任何已知的哺乳動物基因沒有同源性的siRNA。轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA建立了一個效應(yīng)基線，用于確定表型或基因表達(dá)的變化是非特異性的。在每次實驗中都應(yīng)轉(zhuǎn)染一個陰性對照siRNA。QIAGEN提供各類經(jīng)實驗驗證的陰性對照。

QIAGEN 還提供帶有熒光標(biāo)記的negtive siRNA，同時監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。AllStars Neg. siRNA AF 488?、AllStars Neg. siRNA AF 647?。

③?Mock對照

Mock對照即模擬轉(zhuǎn)染對，細(xì)胞在不添加siRNA的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)染過程（即，細(xì)胞只用轉(zhuǎn)染試劑處理）。該對照用于確定由轉(zhuǎn)染試劑或過程可能引起的任何非特異性效應(yīng)。

④?空白對照

使用未處理的細(xì)胞作為對照，以測量正常的、基礎(chǔ)的基因表達(dá)水平。來自未處理細(xì)胞的結(jié)果可以用來與來自所有其他樣本的結(jié)果進(jìn)行比較。未經(jīng)處理的細(xì)胞應(yīng)該在每個實驗中進(jìn)行分析。

⑤?使用多個sirna進(jìn)行表型確認(rèn)

RNAi研究來說，off-target效應(yīng)是一個十分關(guān)注的問題，有大量證據(jù)證明一個siRNA可能影響多個基因的表達(dá)，所以由基因敲低引起的表型效應(yīng)必須使用至少一個針對mRNA的siRNA不同區(qū)域的siRNA來確認(rèn)。一般每個基因使用兩到四條有效的siRNA序列。其表型效應(yīng)應(yīng)趨向于一致性，并且呈現(xiàn)相應(yīng)劑量效應(yīng)。QIAGEN針對次效應(yīng)設(shè)計FlexiTube GeneSolution，其中包含4條siRNA的預(yù)混液，高效防脫靶。

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