實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。

Real-timePCR原理

1.1?熒光染料和熒光探針

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種。非探針類則是利用熒光染料（如SYBR Green I）或者特殊設(shè)計(jì)的引物(如LUX Primers)來指示擴(kuò)增的增加。???探針類(TaqMan探針和 分子信標(biāo))是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。探針類由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但實(shí)時(shí)熒光定量 PCR則簡便易行。

1.2?SYBR GreenI工作原理?

SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。SYBR GreenI的最大吸收波長約為497nm ，發(fā)射波長最大約為520nm。????在PCR反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

1.3?LUX 引物工作原理?

LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實(shí)現(xiàn)定量的一項(xiàng)新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對(duì)中的一個(gè)引物 3’ 端用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標(biāo)片斷的時(shí)候，引物與模板配對(duì)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號(hào)。

1.4?TaqMan探針工作原理

1.5?分子信標(biāo)（molecular beacon）工作原理

分子信標(biāo)：一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個(gè)核苷酸長，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì)，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時(shí)則與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，它發(fā)出自身波長的光子。

1.6?熒光閾值(Threshold)?

Ct值是擴(kuò)增DNA的量達(dá)到閾值時(shí)候的循環(huán)次數(shù)。Ct 值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， Ct值越小。????利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表 Ct 值（如圖所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)

Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析

基線（baseline)：通常是3－15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線。

閾值（threshold)：自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Ct值：與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系

分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

相對(duì)定量：通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計(jì)算基因之間的表達(dá)差異,一般是

2-△△Ct?。或者是考慮擴(kuò)增效率的Pfaffl法。

作者：海星生物

公眾號(hào)：Cas9X細(xì)胞基因敲除

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