干細胞是未分化的生物細胞，是可以專門分化的細胞，并且可以分裂（通過有絲分裂）以產(chǎn)生更多的干細胞。它們存在于多細胞生物中。在哺乳動物中，干細胞有兩種類型：從胚泡的內(nèi)部細胞團中分離出來的胚胎干細胞和在各種組織中發(fā)現(xiàn)的原代細胞。在成年生物中，干細胞和原代細胞可以用作人體的修復系統(tǒng)，以補充成年組織。在發(fā)育中的胚胎中，干細胞可以分化為所有專門的細胞-外胚層，內(nèi)胚層和中胚層-但可以維持再生器官（例如血液，皮膚或腸道組織）的正常周轉(zhuǎn)。

精密醫(yī)學：源自患者的干細胞中色素性視網(wǎng)膜炎的基因修復

來自患者成纖維細胞的誘導性多能干細胞（iPSC）可用作自體細胞的來源，用于視網(wǎng)膜疾病的移植。但是，患者來源的iPSC仍然攜帶病原突變。為了生成健康的患者源細胞，一種基于短回文重復序列（CRISPR）/Cas9的細菌系統(tǒng)（簇狀分布）的基因編輯技術(shù)可用于修復突變，從而產(chǎn)生不需要患者免疫抑制的新型植物。研究人員測試了CRISPR / Cas9是否可以用于患者特異性iPSC中以精確修復導致X連鎖性色素性視網(wǎng)膜炎（XLRP）的RPGR點突變。從XLRP患者的針頭活檢培養(yǎng)的成纖維細胞被轉(zhuǎn)導產(chǎn)生具有患者c.3070G> T突變的iPSC。使用CRISPR指導RNA，Cas9核酸內(nèi)切酶和供體同源性轉(zhuǎn)導的iPSC。盡管該基因具有重復序列和富含GC的序列，但RPGR基因拷貝中有13％顯示出基因突變糾正和轉(zhuǎn)化為野生型等位基因。這是首次使用CRISPR糾正患有感光細胞變性患者的iPSC中的致病突變。這一重要的概念驗證發(fā)現(xiàn)支持針對視網(wǎng)膜疾病的個性化基于iPSC的移植治療的發(fā)展。

CRISPR /Cas9β-globin基因靶向人類造血干細胞

β-血紅蛋白病，如鐮狀細胞病和β-地中海貧血，是由β-球蛋白（HBB）基因突變引起的，并影響全球數(shù)百萬人。研究人員提出了一種CRISPR / Cas9基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)將Cas9核糖核蛋白和腺相關(guān)病毒載體同源供體結(jié)合在一起，以移植人造血干細胞，該造血干細胞可以在患者來源的造血干細胞中進行體外基因校正，然后進行自體移植。在造血干細胞的HBB基因上實現(xiàn)了同源重組。值得注意的是，研究人員設(shè)計了一個富集模型，以超過90％的靶向整合率純化造血干細胞和祖細胞。研究人員還表明，通過使用患者來源的干細胞和祖細胞，它們可以分化為紅細胞并表達成年β-球蛋白（HbA）信使RNA，從而有效地糾正了導致鐮狀細胞病的Glu6Val突變。這證實了細胞編輯的HBB等位基因的完全轉(zhuǎn)錄調(diào)控。總之，這些臨床前研究概述了一種基于CRISPR的方法，該方法通過HBB位點的同源重組靶向造血干細胞，從而促進了β-血紅蛋白病的下一代療法的發(fā)展。

CRISPR–Cas9誘導的雙鏈斷裂的修復導致大量缺失和復雜的重排

CRISPR–Cas9有望成為臨床環(huán)境中首選的基因編輯工具。到目前為止，Cas9誘導的遺傳變化的探索僅限于靶位點的近端和遠距離脫靶序列，并且得出結(jié)論CRISPR-Cas9具有合理的特異性。研究人員報道了主要的目標誘變，例如小鼠胚胎干細胞，小鼠造血祖細胞和人類分化的細胞系，這些細胞系具有大量的靶位點缺失和更復雜的基因組重排。研究人員使用了長讀測序和長距離PCR基因分型方法，發(fā)現(xiàn)單個向?qū)NA/Cas9引入的DNA斷裂通常被解析為多堿基缺失。另外，在切口部位的遠端處發(fā)現(xiàn)了病變和交叉事件。 CRISPR–Cas9編輯引起的有絲分裂活躍細胞中觀察到的基因組損傷可能是致病的。

由Ubigene開發(fā)的CRISPR-U?（基于CRISPR / Cas9技術(shù)）在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而且CRISPR-U?可以大大提高同源重組的效率并輕松實現(xiàn)敲除（KO），體外和體內(nèi)的點突變（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U? Ubigene已成功編輯了100多個細胞系的基因。

Reference

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Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol 36, 765–771 (2018). https://doi.org/10.1038/nbt.4192

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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