基因編輯干細胞基因編輯技術(shù)-源井生物

干細胞是未分化的生物細胞,是可以專門分化的細胞,并且可以分裂(通過有絲分裂)以產(chǎn)生更多的干細胞。它們存在于多細胞生物中。在哺乳動物中,干細胞有兩種類型:從胚泡的內(nèi)部細胞團中分離出來的胚胎干細胞和在各種組織中發(fā)現(xiàn)的原代細胞。在成年生物中,干細胞和原代細胞可以用作人體的修復(fù)系統(tǒng),以補充成年組織。在發(fā)育中的胚胎中,干細胞可以分化為所有專門的細胞-外胚層,內(nèi)胚層和中胚層-但可以維持再生器官(例如血液,皮膚或腸道組織)的正常周轉(zhuǎn)。
精密醫(yī)學(xué):源自患者的干細胞中色素性視網(wǎng)膜炎的基因修復(fù)
來自患者成纖維細胞的誘導(dǎo)性多能干細胞(iPSC)可用作自體細胞的來源,用于視網(wǎng)膜疾病的移植。但是,患者來源的iPSC仍然攜帶病原突變。為了生成健康的患者源細胞,一種基于短回文重復(fù)序列(CRISPR)/Cas9的細菌系統(tǒng)(簇狀分布)的基因編輯技術(shù)可用于修復(fù)突變,從而產(chǎn)生不需要患者免疫抑制的新型植物。研究人員測試了CRISPR / Cas9是否可以用于患者特異性iPSC中以精確修復(fù)導(dǎo)致X連鎖性色素性視網(wǎng)膜炎(XLRP)的RPGR點突變。從XLRP患者的針頭活檢培養(yǎng)的成纖維細胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生具有患者c.3070G> T突變的iPSC。使用CRISPR指導(dǎo)RNA,Cas9核酸內(nèi)切酶和供體同源性轉(zhuǎn)導(dǎo)的iPSC。盡管該基因具有重復(fù)序列和富含GC的序列,但RPGR基因拷貝中有13%顯示出基因突變糾正和轉(zhuǎn)化為野生型等位基因。這是首次使用CRISPR糾正患有感光細胞變性患者的iPSC中的致病突變。這一重要的概念驗證發(fā)現(xiàn)支持針對視網(wǎng)膜疾病的個性化基于iPSC的移植治療的發(fā)展。
CRISPR /Cas9β-globin基因靶向人類造血干細胞
β-血紅蛋白病,如鐮狀細胞病和β-地中海貧血,是由β-球蛋白(HBB)基因突變引起的,并影響全球數(shù)百萬人。研究人員提出了一種CRISPR / Cas9基因編輯系統(tǒng),該系統(tǒng)將Cas9核糖核蛋白和腺相關(guān)病毒載體同源供體結(jié)合在一起,以移植人造血干細胞,該造血干細胞可以在患者來源的造血干細胞中進行體外基因校正,然后進行自體移植。在造血干細胞的HBB基因上實現(xiàn)了同源重組。值得注意的是,研究人員設(shè)計了一個富集模型,以超過90%的靶向整合率純化造血干細胞和祖細胞。研究人員還表明,通過使用患者來源的干細胞和祖細胞,它們可以分化為紅細胞并表達成年β-球蛋白(HbA)信使RNA,從而有效地糾正了導(dǎo)致鐮狀細胞病的Glu6Val突變。這證實了細胞編輯的HBB等位基因的完全轉(zhuǎn)錄調(diào)控??傊@些臨床前研究概述了一種基于CRISPR的方法,該方法通過HBB位點的同源重組靶向造血干細胞,從而促進了β-血紅蛋白病的下一代療法的發(fā)展。
CRISPR–Cas9誘導(dǎo)的雙鏈斷裂的修復(fù)導(dǎo)致大量缺失和復(fù)雜的重排
CRISPR–Cas9有望成為臨床環(huán)境中首選的基因編輯工具。到目前為止,Cas9誘導(dǎo)的遺傳變化的探索僅限于靶位點的近端和遠距離脫靶序列,并且得出結(jié)論CRISPR-Cas9具有合理的特異性。研究人員報道了主要的目標誘變,例如小鼠胚胎干細胞,小鼠造血祖細胞和人類分化的細胞系,這些細胞系具有大量的靶位點缺失和更復(fù)雜的基因組重排。研究人員使用了長讀測序和長距離PCR基因分型方法,發(fā)現(xiàn)單個向?qū)NA/Cas9引入的DNA斷裂通常被解析為多堿基缺失。另外,在切口部位的遠端處發(fā)現(xiàn)了病變和交叉事件。 CRISPR–Cas9編輯引起的有絲分裂活躍細胞中觀察到的基因組損傷可能是致病的。
由Ubigene開發(fā)的CRISPR-U?(基于CRISPR / Cas9技術(shù))在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效,而且CRISPR-U?可以大大提高同源重組的效率并輕松實現(xiàn)敲除(KO),體外和體內(nèi)的點突變(PM)和敲入(KI)。借助CRISPR-U? Ubigene已成功編輯了100多個細胞系的基因。
Reference
Bassuk, A., Zheng, A., Li, Y. et al. Precision Medicine: Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in Patient-Derived Stem Cells. Sci Rep 6, 19969 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19969
Dever, D., Bak, R., Reinisch, A. et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature 539, 384–389 (2016). https://doi.org/10.1038/nature20134
Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol 36, 765–771 (2018). https://doi.org/10.1038/nbt.4192

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力,而且具有多種優(yōu)勢,是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先,它在谷氨酸上羧基化,在酪氨酸上硫酸化。第二,操作簡單,通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三,可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系,對GLUL基因組位點進行靶向測序,產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。
根據(jù)科研需求,結(jié)合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計
方案1:小片段基因敲除方案,gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中,敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù),敲除后可造成移碼。
方案2:移碼基因敲除方案,gRNA設(shè)在外顯子上,缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù),敲除后可發(fā)生移碼突變。
方案3:大片段基因敲除方案,將整個基因的編碼序列敲除,達到大片段敲除的效果。
注明 | 文章是源井生物原創(chuàng),轉(zhuǎn)載請注明。