什么是定點誘變

定點誘變是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于將基因核苷酸序列的特定變化引入。它用于改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，引入或去除限制性位點，破壞轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點以及產(chǎn)生融合蛋白。

過程

在定點誘變過程中，使用引物將突變引入質(zhì)粒，引物由所需的突變組成。整個模板通過PCR擴(kuò)增，將突變合并到模板中。然后，使用酶，甲基化依賴性核酸內(nèi)切酶從樣品中除去母體模板。PCR產(chǎn)物或具有所需突變的切口質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)化為細(xì)菌。質(zhì)?？梢酝ㄟ^所需的修飾從細(xì)菌中分離出來。定點誘變的過程如圖1所示。

圖1：定點誘變

三種主要類型的方法用于在定點誘變中引入所需的突變。它們是傳統(tǒng)的 PCR、引物延伸和反向 PCR。引物延伸和反向PCR可用于引入大規(guī)模核苷酸變化。

如何設(shè)計定點誘變引物

定點誘變是通過引物引入所需突變的過程。突變可以是替換、插入或刪除。隨著引物中錯配核苷酸的增加，PCR的特異性降低，傳統(tǒng)的PCR只能向靶序列引入一兩個堿基對變化。引物延伸和反向PCR等其他方法可用于引入大規(guī)模突變。定點誘變中的引物設(shè)計如圖2所示。

圖2：用于定點誘變的引物

替代：對于置換，兩個引物中的一個應(yīng)在引物中間包含所需的突變。在這里，包含突變的位點不會退火到靶序列，因為它會形成扭曲。

刪除：對于缺失，在引物設(shè)計過程中可以忽略要從靶標(biāo)中刪除的序列。由于該序列通過引物與側(cè)翼區(qū)域分開，因此在PCR過程中不會擴(kuò)增。

插入：對于插入，在引物設(shè)計過程中，要添加的序列糾纏到其中一個引物的5'末端。因此，插入的序列也可以保持附著在擴(kuò)增子上。

結(jié)論

定點誘變是一種用于將突變引入DNA序列的技術(shù)。這些突變可以是替換、插入或刪除。在傳統(tǒng)的PCR中可以引入小規(guī)模突變。大規(guī)模突變可以在引物延伸或反向PCR中引入。突變的引入是通過將所需的突變摻入引物來完成的。