前言

2022年7月12日，山東第一醫(yī)科大學(xué)史偉云教授和高華教授團(tuán)隊(duì)于Cell Discovery（IF：38.079）在線發(fā)表了眼科疾病圓錐角膜單細(xì)胞測(cè)序的最新研究成果。作者對(duì)3例圓錐角膜患者中獲取的中央角膜組織和4例健康對(duì)照者的中央角膜組織進(jìn)行了10x Genomics高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，繪制了圓錐角膜的單細(xì)胞圖譜，強(qiáng)調(diào)了角膜基質(zhì)細(xì)胞在圓錐角膜形成中的關(guān)鍵作用，為深入理解圓錐角膜的發(fā)病機(jī)制提供了重要參考。

研究背景

圓錐角膜是在青少年中常見的角膜擴(kuò)張性疾病，可導(dǎo)致進(jìn)行性的視力下降甚至失明。角膜移植是治療圓錐角膜最后可行的方案，但是給患者和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。盡管患病率很高，但其病因尚不完全清楚。

本研究對(duì)來自圓錐角膜患者和健康個(gè)體中央角膜的39214個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-Seq）分析，以確定角膜中不同細(xì)胞類型在該疾病進(jìn)展中的變化。本研究有助于理解圓錐角膜發(fā)病的分子機(jī)制，為圓錐角膜的預(yù)防和診療提供了新的見解。

期刊：Cell Discovery

影響因子：38.079

發(fā)表年月：2022年7月12日

材料：3例圓錐角膜患者中獲取的中央角膜組織和4例健康對(duì)照者的中央角膜組織

方法：10x Genomics高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

研究結(jié)果

1. 圓錐角膜和健康角膜的細(xì)胞類型鑒定

為了全面了解患者的圓錐角膜和健康人正常角膜的細(xì)胞多樣性和分子特征，研究從板層角膜移植術(shù)(DALK)后的圓錐角膜患者中獲取3個(gè)中央角膜組織，從健康對(duì)照者中獲取4個(gè)對(duì)照的中央角膜組織。將每個(gè)樣本的組織分離，分別進(jìn)行10X Genomics的scRNA-Seq(圖1A)。所有圓錐角膜患者嚴(yán)重程度的評(píng)分均為5分。圓錐角膜表現(xiàn)為圓錐頂部突出和變薄、矢狀曲率等病理生物學(xué)特征（圖1B, 1C)。

經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量控制步驟和去除雙細(xì)胞，所有樣本共獲得39214個(gè)細(xì)胞，其中20312個(gè)細(xì)胞來自圓錐角膜，18902個(gè)細(xì)胞來自健康角膜，平均每個(gè)細(xì)胞有3339個(gè)基因和18247個(gè)轉(zhuǎn)錄本。所有樣本的細(xì)胞被劃分為6個(gè)細(xì)胞群（圖1D），根據(jù)經(jīng)典的特異性標(biāo)記基因?qū)?群細(xì)胞注釋3種細(xì)胞類型，即角膜上皮細(xì)胞(CEC，表達(dá)KRT3、KRT12和KRT14)，角膜基質(zhì)細(xì)胞(CSC，表達(dá)DCN、KERA和LUM)以及少量免疫細(xì)胞(ImC，表達(dá)CD45) (圖1E, 1F)。

此外，研究分析了細(xì)胞類型特異性的生物學(xué)功能。三種細(xì)胞類型在圓錐角膜和健康角膜樣本中的比例沒有顯著差異(圖1I,1J)，表明在圓錐角膜的病理機(jī)制中，細(xì)胞的基因表達(dá)異?？赡鼙燃?xì)胞比例的改變更為重要。

圖1 | scRNA-Seq分析人圓錐角膜和健康角膜的細(xì)胞組成

2. 圓錐角膜細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄信號(hào)改變

研究比較了圓錐角膜和健康角膜中每種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄特征。有340個(gè)上調(diào)基因和422個(gè)下調(diào)基因在至少一種細(xì)胞類型中被檢測(cè)到，大多數(shù)差異基因表現(xiàn)為細(xì)胞類型特異性的特征(圖2A)。角膜基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)的基因參與膠原代謝過程和細(xì)胞外基質(zhì)降解，符合圓錐角膜降解和基質(zhì)變薄的臨床表現(xiàn)；角膜上皮細(xì)胞上調(diào)的基因參與“角質(zhì)化”和“上皮細(xì)胞分化”等過程；免疫細(xì)胞上調(diào)的基因參與免疫相關(guān)過程，如白細(xì)胞遷移和炎癥反應(yīng)(圖2B)。作者從OMIM Clinical Synopsis (https://www.omim.org)下載了136個(gè)圓錐角膜相關(guān)基因，結(jié)合scRNA-Seq鑒定的細(xì)胞類型，繪制了細(xì)胞類型特異性的圓錐相關(guān)基因的表達(dá)譜，且發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)細(xì)胞中富集的圓錐相關(guān)基因比例最高(圖2C)。

接下來，作者比較了已知的圓錐角膜相關(guān)基因（膠原家族成員、細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因）在不同細(xì)胞類型中特異性的表達(dá)模式。幾乎所有膠原基因在基質(zhì)細(xì)胞中均表達(dá)豐富，COL5A1、COL5A3等基因在圓錐角膜組下調(diào)，解釋了圓錐角膜疾病中膠原纖維減少的原因；細(xì)胞外基質(zhì)基因在圓錐角膜組的基質(zhì)細(xì)胞中廣泛下調(diào)；基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因在圓錐角膜組的基質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)(圖2D)。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)膠原家族成員、細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因并不局限于基質(zhì)細(xì)胞，某些基因在其他細(xì)胞類型中差異表達(dá)，表明所有類型的角膜細(xì)胞均可能在圓錐角膜的細(xì)胞外基質(zhì)失調(diào)中發(fā)揮重要作用。

為了評(píng)估轉(zhuǎn)錄因子(TF)在圓錐角膜和健康角膜中的表達(dá)狀態(tài)，作者進(jìn)行了單細(xì)胞SCENIC分析，鑒定到圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中NFKB1、EGR1、BCLAF1、CEBPD和XBP1等5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子減少(圖2E)，其中一些與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的靶基因FN1、COL12A1、TIMP3和FBLN5等在圓錐角膜中也表達(dá)下調(diào)(圖2F)。作者進(jìn)一步證實(shí)，這些轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)靶基因在細(xì)胞外基質(zhì)、膠原合成和細(xì)胞凋亡等功能顯著富集(圖2G)?？傊?，作者確定了特定細(xì)胞類型中候選轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)，并揭示了它們?cè)趫A錐角膜進(jìn)展中可能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。

圖2 | 圓錐角膜每種細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)錄譜和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化

3. 機(jī)械力與圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化

作者從圓錐角膜和健康角膜基質(zhì)細(xì)胞的差異基因(圖2A)中，選擇了top基因進(jìn)行進(jìn)一步研究(圖3A)。圓錐角膜的基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)的基因包括MMP1和MMP3(圖3B)，它們能夠降解纖維性角膜膠原，并在圓錐角膜基質(zhì)變少中發(fā)揮作用。作者鑒定了兩種新的潛在的圓錐角膜相關(guān)酶基因CTSD和CTSK，免疫組化分析證實(shí)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中CTSD和CTSK蛋白水平升高(圖3C)，為圓錐角膜的診斷和治療提供了新的生物標(biāo)志和潛在靶點(diǎn)。

“揉眼”在臨床上被認(rèn)為是圓錐角膜患病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，但機(jī)械力如何影響圓錐角膜的發(fā)病、以及機(jī)械力和圓錐角膜基質(zhì)降解之間的關(guān)系并不明確。作者發(fā)現(xiàn)兩個(gè)核心的力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子YAP1和TEAD1在圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中均升高，意味著圓錐角膜中的基質(zhì)細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的響應(yīng)(圖3D)。進(jìn)一步通過對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞系進(jìn)行機(jī)械力牽張實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞加力之后，角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)包括MMP1、MMP3、CTSD以及CTSK在內(nèi)的蛋白酶表達(dá)顯著上調(diào)（圖3E-3G），提示角膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)機(jī)械力是有響應(yīng)的，且施加機(jī)械力會(huì)促進(jìn)多種蛋白酶的表達(dá)，從生物力-蛋白酶作用軸的角度解釋了“揉眼通過力學(xué)信號(hào)促進(jìn)蛋白酶分泌機(jī)制加劇圓錐角膜發(fā)展”的臨床現(xiàn)象，同時(shí)也為臨床預(yù)防圓錐角膜進(jìn)展提供了重要的理論基礎(chǔ)。

接下來，作者研究了圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性，將基質(zhì)細(xì)胞分為5個(gè)亞群C0-C4（圖3H)，圓錐角膜和健康角膜樣本中亞群分布類似。功能富集顯示細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)過程在C0和C2中富集，對(duì)缺氧的反應(yīng)項(xiàng)在C1中富集，對(duì)未折疊蛋白的反應(yīng)在C3和C4中富集，表明基質(zhì)細(xì)胞功能或狀態(tài)存在異質(zhì)性（圖3I）。作者評(píng)估了本研究鑒定的圓錐角膜相關(guān)基因在不同基質(zhì)亞型中的特異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因在C0-C2細(xì)胞中富集（圖3I，3J）。

圖3 | 圓錐角膜和健康角膜中角膜基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變和異質(zhì)性分析

4. 圓錐角膜樣本中分化異常的角膜表層上皮細(xì)胞

為了深入分析圓錐角膜上皮細(xì)胞以及轉(zhuǎn)錄變化，作者對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了無監(jiān)督的重聚類，圓錐角膜上皮細(xì)胞被分為角膜基底細(xì)胞(CBCs，表達(dá)GJA1)，角膜上皮層基底細(xì)胞(CSbCs，表達(dá)KRT3)和角膜淺表細(xì)胞（CSfCs，表達(dá)IVL和LYPD2）（圖4A，4B）。根據(jù)角膜上皮細(xì)胞上調(diào)的基因參與“角質(zhì)化”和“上皮細(xì)胞分化”等功能（圖2B），作者對(duì)三種與角質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)基因的進(jìn)行了評(píng)分，所有圓錐角膜上皮細(xì)胞亞型的得分均顯著較高，尤其角膜表層上皮細(xì)胞(圖4C)。

然后作者分析了角質(zhì)化和分化相關(guān)基因細(xì)胞類型特異性的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)這兩組基因在圓錐角膜樣本中富集，尤其是角膜淺表細(xì)胞。從其中鑒定出一種在角膜淺表細(xì)胞高度特異表達(dá)的基因KRT80，與晚期組織或細(xì)胞分化有關(guān)（圖4D）。免疫組化染色證實(shí)圓錐角膜角膜淺層存在的KRT80信號(hào)（圖4E）。角膜淺表細(xì)胞另一個(gè)顯著增加的基因SPRR1B 是鱗狀化生的生物標(biāo)志（圖4F）。這些數(shù)據(jù)顯示圓錐角膜患者淺表細(xì)胞分化活躍，角化和鱗狀化生信號(hào)增加。

圖4 | 圓錐角膜上皮轉(zhuǎn)錄變化的異質(zhì)性

5. 免疫細(xì)胞在圓錐角膜病變中的作用

圓錐角膜是否具有炎癥特性一直存在爭(zhēng)議。作者將免疫細(xì)胞重新進(jìn)行無監(jiān)督聚類后，在圓錐角膜和健康角膜中鑒定出巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞(圖5A)，但沒有發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞比例在組間的變化（圖5B）。圓錐角膜中巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞上調(diào)的基因富集炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)分解;在樹突狀細(xì)胞中富集對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng);而T細(xì)胞富集于T細(xì)胞受體信號(hào)通路和ATP生物合成過程(圖5C)。多種白細(xì)胞介素(如IL23A)和趨化因子(如CXCL1)在圓錐角膜的樹突狀細(xì)胞中顯著升高，表明在圓錐角膜發(fā)病過程中免疫反應(yīng)被激活(圖5D)。該部分為圓錐角膜的炎癥特性的提供了證據(jù)。

圖5 | 免疫細(xì)胞貢獻(xiàn)圓錐角膜中的炎癥信號(hào)

6. 圓錐角膜細(xì)胞間通訊異常

圓錐角膜具有異常的生物力學(xué)特性，作者分析了YAP信號(hào)通路中基因的表達(dá)，觀察到在角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞中均多個(gè)基因下調(diào)，并鑒定了關(guān)鍵基因YAP1在角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞亞型中表達(dá)水平（圖6A，6B）。

圖6 | 細(xì)胞間通訊信號(hào)中與圓錐角膜相關(guān)的變化

作者進(jìn)行了細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析(CellPhoneDB)，發(fā)現(xiàn)圓錐角膜中只有很少的相互作用，大部分細(xì)胞間相互作用消失，尤其是角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞之間以及角膜上皮細(xì)胞自分泌信號(hào)?？紤]到基質(zhì)是圓錐角膜進(jìn)展過程中發(fā)生變薄和膠原降解的主要部位，作者重點(diǎn)研究了與角膜基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞間作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間信號(hào)的下調(diào)（圖6C）。角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞之間消失的相互作用，如FGFR2-XPR1, FGFR2-CD83等與成纖維細(xì)胞生長因子信號(hào)通路相關(guān)(圖6D)。免疫細(xì)胞與角膜基質(zhì)細(xì)胞之間消失的相互作用，如IL1RN-IL1受體抑制劑、IL1RN-IL1受體與抗炎反應(yīng)有關(guān) (圖6E)。

此外，NicheNet預(yù)測(cè)免疫細(xì)胞衍生的IL24可能會(huì)誘導(dǎo)圓錐角膜的角膜基質(zhì)細(xì)胞中MMP1的差異表達(dá)。MMP2在角膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)與免疫細(xì)胞衍生的APOE和MMP9相關(guān)。MMP3與免疫細(xì)胞衍生的MMP9和角膜上皮細(xì)胞衍生的LGALS3相關(guān)。重要的是，金屬肽酶抑制劑基因TIMP2與免疫細(xì)胞衍生的APOE和POMC相關(guān)（圖6F）。這些結(jié)果表明，在圓錐角膜進(jìn)展過程中，MMPs和TIMPs的平衡是角膜基質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)完整性和功能的關(guān)鍵決定因素，可能受角膜基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞/角膜上皮細(xì)胞之間的通訊調(diào)節(jié)。

文章總結(jié)

作者系統(tǒng)地研究了圓錐角膜和健康角膜樣本之間的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組，證實(shí)了角膜基質(zhì)細(xì)胞在該疾病中的關(guān)鍵作用。研究證明了角膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解在該疾病中的重要作用，揭示了“機(jī)械力—力學(xué)信號(hào)—蛋白酶”作用軸在促進(jìn)圓錐角膜進(jìn)展中的重要作用，為“揉眼可加劇圓錐角膜”的臨床現(xiàn)象提供了解釋。此外，角膜上皮病變、免疫細(xì)胞中炎癥信號(hào)的增強(qiáng)以及細(xì)胞間通訊失調(diào)也參與了圓錐角膜的形成（圖7）。以上發(fā)現(xiàn)為圓錐角膜基礎(chǔ)研究、深入理解圓錐角膜等擴(kuò)張性疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)資源和理論參考，更為該疾病的預(yù)防和診療提供了理論依據(jù)。

圖7 | 腫瘤和免疫細(xì)胞之間基于配體受體的細(xì)胞間通訊

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