首先，轉錄因子是什么？直接上概念，轉錄因子(Transcription Factors, TFs)指能夠以序列特異性方式結合DNA并且調節(jié)轉錄的蛋白質。對于這個概念需要重點關注的是1、轉錄因子主要功能是來調節(jié)基因的轉錄水平；2、這種調節(jié)是通過結合DNA來實現(xiàn)的；3、結合的DNA具有序列特異性。因此對于研究一個轉錄因子，需要重點闡述清楚這兩個事情，一個是結合的DNA是什么，特異性的結合序列是哪些， 二是可能調控的基因是什么。那么對于轉錄因子，闡述清楚這兩個就可以了嗎？這也太小看轉錄因子了，我們坐下來慢慢說。

還是回到第一個問題，轉錄因子是什么？其實對于大多數(shù)基因而言，更為重要的是這個基因是轉錄因子嗎？這個問題其實不難，現(xiàn)在通過基因的同源注釋即可以推測這個基因是不是一個轉錄因子，背后原因在于轉錄因子都具有保守的結構域，這個結構域包括結合域和調控域，尤為重要的是其中的結合域，原因在于一方面，結合域直接決定了他的結合DNA的情況，另外結合域的保守性決定了這個轉錄因子到底是哪個家族。因此，針對某些物種基因組注釋沒有那么透徹同時又關注某個轉錄因子家族的老師，對研究物種中某個轉錄因子家族基因進行全局鑒定也是研究的方向，是一個短平快的文章很好的選擇（怎么做呢？與常規(guī)修飾酶鑒定等方法一致，還不清楚的話，參考前期文章https://igenebook.biomart.cn/news/3041979.htm）

第一個問題解決了，那第二個問題來了，轉錄因子功能是什么？我們都知道他調控了基因的表達，那調控基因是為了什么呢？這個問題其實就是一個基因功能的驗證的問題，主要可以從兩個方面考慮，首先，表達量，轉錄因子表達有時空特異性，例如NKX1-2轉錄因子，在脂肪細胞分化過程中高度表達，推測與研究證明其與脂質生成相關。干擾素調節(jié)因子4（IRF4）是IRF家族的成員，主要在淋巴細胞中表達，并在淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此對于某些轉錄因子在不同組織類型或者生命過程中具有明顯較高的表達豐度，則可推測其與該生命活動中具有較高相關性。另外就是經(jīng)典基因功能驗證實驗，過表達或者敲除、沉默轉錄因子，通過表型鑒定等推測其功能。

功能已經(jīng)知道了，那下面就要解析機制了。這時候就是要回歸到轉錄因子本身功能特性:第一，與特異性DNA序列結合調節(jié)轉錄，第二，與其他蛋白互作完成功能。因此我們需要解決的主要就是這兩個機制。首先我們先關注互作的蛋白是誰，這個就需要通過CoIP等實驗進行互作的蛋白鑒定，其互作蛋白的特性也賦予了轉錄因子功能上的多樣性，具體功能就需要針對互作蛋白具體蛋白具體分析了。另外就是這個轉錄因子結合的DNA序列到底是什么。這個時候就需要利用經(jīng)典的蛋白和DNA互作的研究手段來進行鑒定了，現(xiàn)在主流的技術手段包括ChIP-seq和CUT-Tag。其中ChIP-seq即染色質免疫共沉淀測序，實驗上是通過染色質提取后，利用特異性的抗體捕獲特異性的蛋白（即我們關注的轉錄因子）同時將轉錄因子上結合的DNA進行捕獲，隨后將DNA進行建庫測序分析，就可以知道結合的DNA到底是什么了。CUT-Tag也是當前利用手段較多的研究蛋白和DNA互作的方法，其原理是抗體進入細胞核后特異性識別和結合目的蛋白，隨后引導Tn5轉座酶在抗體結合區(qū)域進行切割和擴增，隨后通過測序就可以知道結合的DNA序列是什么。ChIP-seq體系穩(wěn)定成熟，適用于大多數(shù)情況，CutTag其背景信號更干凈，且起始量低，適用于珍惜樣本。

測序數(shù)據(jù)下機是一堆的reads，那怎么分析才能知道結合的序列是什么呢？ChIP和CutTag分析流程大體一致，基本原理是找到reads顯著性堆疊的區(qū)域，即peak區(qū)域，則該peak區(qū)域即為分析上蛋白結合的DNA區(qū)域。怎么來理解這個邏輯，原因在于在實際實驗過程中，只有轉錄因子結合的DNA區(qū)域才能夠被多次捕獲，那么捕獲測序的DNA就會明顯多于其他地方（即顯著性堆疊），因此這些peak區(qū)域就可以推測為蛋白結合的DNA區(qū)域。那怎么找到peak呢，現(xiàn)在通用的就是利用MACS2軟件進行call peak（具體MACS2的原理我們就不再解釋了，簡單說就是知道reads很多的地方）。那么針對另外一個問題，怎么知道序列的特異性呢？就需要對peak進行motif（保守結合基序）的分析，常用軟件包括Homer、MEME、MEME-ChIP等，都是很好的進行motif分析的工具，結果都是被認可的。拿到peak之后，我們就可以對peak進行關聯(lián)基因，就可以知道結合DNA最有可能調控的基因是哪些，不過這個時候需要注意，因為轉錄因子結合DNA最終目的是調控基因表達，那這些基因有沒有差異表達呢？這個還是需要通過轉錄組的數(shù)據(jù)和ChIP的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析才可以知道，對于聯(lián)合分析結果進一步進行基因分析等，就可以進一步推測基因功能，并且與前期的功能驗證實驗結合更系統(tǒng)有力地闡述轉錄因子的功能。

最后就需要對ChIP等的結果進行驗證了，一般是對重點關注的結合的DNA（或者說基因）進行驗證，常用用的技術手段包括ChIP-qPCR、EMSA、酵母單雜、雙熒光素酶等實驗。這樣就有更充分的證據(jù)來說明轉錄因子確實結合了關鍵性的基因區(qū)域，完成了轉錄因子調控該基因的表達的功能。

這時候，一個基本的文章就完成了，首先對轉錄因子進行了鑒定，對其“身份”信息進行了確定，隨后對其表達模式進行了研究，并且通過敲除或者過表達驗證其功能，緊接通過互作蛋白和結合DNA的鑒定，并對重要基因進行驗證，最后發(fā)揮一下想象力，構建一個調控網(wǎng)絡，一切完美。

如果還是覺得怎么這么麻煩，那您考慮換個方案，找一下我們--武漢愛基百客生物科技有限公司，從前面基因的鑒定，到中間表達模式分析，到CoIP驗證互作蛋白鑒定、ChIP/Cut-Tag尋找結合DNA和motif，到ChIP-qPCR、EMSA等的驗證，給您提供一條龍的服務，您提供材料，我們一起探索其中的奧秘。

當然，轉錄因子功能的復雜性也遠不止于此，先鋒轉錄因子？轉錄因子和增強子？轉錄因子結合序列DNA甲基化選擇性？這個也不可能只通過這一個思路就完成，我們有機會下次再聊，現(xiàn)在的思路也是一個敲門磚式的研究，推開這個大門，一點一點揭露其神秘面紗。不過，他山之石可以攻玉，我們也整理了一些轉錄因子研究可以用到的網(wǎng)站，包括動植物的已有的轉錄因子網(wǎng)站，轉錄因子抗體怎么選擇，轉錄因子motif查詢，已經(jīng)做了的人和小鼠的ChIP數(shù)據(jù)怎么看，基因啟動子區(qū)可能結合的轉錄因子預測等，關注愛基百客公眾號，后臺回復“ 轉錄因子?”，我們整體打包給您，讓您對手上的轉錄因子有個更清晰的認知。