自上世紀(jì)70年代以來，果葡糖漿開始工業(yè)化生產(chǎn)，并廣泛應(yīng)用于食品和含糖飲料中，導(dǎo)致果糖的攝入量劇增。高果糖攝入與肥胖、糖尿病和脂肪肝、心血管疾病和癌癥的發(fā)病率不斷上升密切相關(guān)。流行病學(xué)研究指出，高果糖攝入與肝細(xì)胞癌（HCC）風(fēng)險正相關(guān)。但高果糖在HCC發(fā)展中的作用和分子機制尚不明確。

2023年10月，重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點實驗室黃愛龍/唐霓團隊在代謝領(lǐng)域權(quán)威期刊Cell Metabolism(IF 29)上在線發(fā)表了題為“High dietary fructose promotes hepatocellular carcinoma progression by enhancing O-GlcNAcylation via microbiota-derived acetate”的論文，詳細(xì)揭示了果糖促進HCC進展的分子機制。中科新生命深度參與研究，共同署名并為該研究提供了非靶代謝組和O-糖基化修飾蛋白質(zhì)組技術(shù)服務(wù)。

?研究材料

飲食果糖或未飲食果糖的HCC小鼠模型肝組織和腫瘤組織

?技術(shù)路線

步驟1：檢測化學(xué)誘導(dǎo)的HCC小鼠模型在攝入果糖后的肝脂肪變性和腫瘤負(fù)荷；

步驟2：利用代謝組檢測果糖攝入改變HCC小鼠肝臟代謝特征；

步驟3：檢測果糖來源的碳是否參與腫瘤的谷氨酰胺積累；

步驟4：檢測谷氨酰胺合成酶(GLUL)在乙酸鹽誘導(dǎo)的O-糖基化和HCC進展的關(guān)鍵作用；

步驟5：利用O-糖基化修飾蛋白質(zhì)組檢測高果糖攝入引起的變化；

步驟6：檢測果糖誘導(dǎo)的eEF1A1和CAPNS1的O-糖基化促進細(xì)胞增殖和HCC進展；

步驟7：檢測腸道菌群乙酸鹽在O-糖基化增強和HCC進展中的作用。

?主要內(nèi)容

1. 果糖加速小鼠肝癌的腫瘤進展

研究者給野生型和二乙基亞硝胺（DEN）和CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌(HCC)小鼠飲用含或不含30%果糖（Frucose）的飲用水10周后，檢測小鼠肝臟的脂肪變性和腫瘤負(fù)荷。結(jié)果顯示DEN+CCl4+Fru的小鼠有更顯著的體重增加、更嚴(yán)重的肝損傷和纖維化，以及更高的腫瘤負(fù)荷，但并無血清甘油三酯（TG）的升高、糖耐受障礙和過量的糖原積累。

2. 高果糖誘導(dǎo)的O-糖基化促進HCC進展

（1）代謝組檢測

研究者對肝組織和腫瘤組織進行了非靶代謝組檢測，以揭示果糖是否誘導(dǎo)代謝微環(huán)境改變進而影響HCC進展。結(jié)果顯示，高果糖攝入改變了肝的代謝組特征。與此前的結(jié)果一致，在WT+Fru小鼠而非DEN+CCl4+Fru中有顯著的脂質(zhì)和脂質(zhì)樣分子積累。與DEN+CCl4小鼠相比，DEN+CCl4+Fru抗壞血酸和醛酸代謝、戊糖磷酸途徑和嘧啶代謝通路中的代謝物在DEN+CCl4+Fru中顯著上調(diào)。如參與嘧啶代謝的谷氨酰胺、UDP、UMP和dUMP在DEN+CCl4+Fru中顯著上調(diào)。

（2）O-糖基化水平檢測

O-GlcNAc糖基化（以下簡稱O-糖基化）是一種發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸上的可逆的翻譯后修飾，它的水平是高度營養(yǎng)敏感的，且依賴于其前體UDP-GlcNAc(己糖胺合成途徑（HBP）的終產(chǎn)物)。目前已報道，O糖基化參與多種腫瘤進展。鑒于多種HBP代謝物在果糖攝入后發(fā)生顯著變化，研究者接下來探究果糖對O-糖基化的調(diào)控。首先發(fā)現(xiàn)DEN+CCl4+Fru而非WT+Fru的小鼠肝組織中有更強的O-糖基化。隨后，研究者敲除了肝組織中的Ogt（O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶）基因。與未敲除Ogt的Fru組小鼠相比，Ogt敲除后的Fru組小鼠的肝組織中有顯著降低的Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）、肝臟與體重比、最大腫瘤大小和絕對的腫瘤負(fù)荷。綜合以上表明，高果糖攝入通過增強O-糖基化促進HCC進展。

3. 果糖來源的碳促進腫瘤的谷氨酰胺累積

研究者通過U-13C-標(biāo)記的果糖對小鼠進行灌胃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與WT+Fru小鼠相比，DEN+CCl4+Fru小鼠有更高的13C標(biāo)記的谷氨酸鹽和谷氨酰胺。此外，分析TCA循環(huán)中間代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，在DEN+CCl4+Fru小鼠中TCA循環(huán)顯著增強。以上結(jié)果表明，在果糖富裕的環(huán)境中，HCC細(xì)胞利用果糖來源的碳源提高谷氨酰胺合成。

4. GLUL是乙酸鹽誘導(dǎo)的O-糖基化和HCC進展的關(guān)鍵蛋白

為探究果糖來源的乙酸鹽是否參與谷氨酰胺積累，研究者分離原代肝細(xì)胞（PMH）和原代肝癌細(xì)胞(PMHC)，并在體外用乙酸鹽進行處理，結(jié)果在原代肝癌細(xì)胞中檢測到了上調(diào)的谷氨酰胺和UDP-GlcNAc。原代肝癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中總O-糖基化的水平以乙酸鹽濃度依賴的形式上調(diào)。而在原代肝細(xì)胞中，則無明顯變化。這表明，是肝癌細(xì)胞而非肝細(xì)胞通過利用外源性的乙酸鹽促進細(xì)胞O-糖基化?？紤]到谷氨酰胺合成酶(GLUL)參與合成的谷氨酰胺在UTP合成中的重要作用，研究者假設(shè)GLUL在乙酸鹽誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞O-糖基化中起到關(guān)鍵作用。GLUL敲低導(dǎo)致原代肝癌細(xì)胞中谷氨酰胺和UDP-GlcNAc下調(diào)。而谷氨酰胺的再補充則挽救了GLUL敲低導(dǎo)致的UDP-GlcNAc和O-糖基化水平下調(diào)。更進一步，敲低GLUL顯著下調(diào)谷氨酰胺、UDP-GlcNAc和O-糖基化。果糖誘導(dǎo)的HCC進展也被抑制。綜合以上表明，GLUL對飲食果糖誘導(dǎo)的HCC發(fā)展是關(guān)鍵的。

5. O-糖基化蛋白組揭示高果糖攝入引起的變化

研究者采用O-糖基化修飾蛋白質(zhì)組檢測了攝入果糖（n=3）和未攝入果糖（n=3）的DEN+CCl4誘導(dǎo)的肝癌小鼠的腫瘤組織中的分子變化。共檢測到284個O-糖基化蛋白上的1224個O-糖基化位點。定量分析發(fā)現(xiàn)，DEN+CCl4+Fru組的O-糖基化蛋白表達強度高于DEN+CCl4組。促瘤因子CAPNS1和eEF1A1僅在DEN+CCl4+Fru組檢出。研究者通過親和層析檢測發(fā)現(xiàn)，高果糖顯著增加了CAPNS1和eEF1A1的O-糖基化。因此，研究者假設(shè)高果糖攝入導(dǎo)致的CAPNS1和eEF1A1的O-糖基化增加促進了HCC進展。

6. 果糖誘導(dǎo)的eEF1A1和CAPNS1的O-糖基化促進細(xì)胞增殖和HCC進展

O-糖基化蛋白質(zhì)組的結(jié)果顯示，eEF1A1和CAPNS1糖基化的位點分別為T279和S88。序列分析顯示，這兩個位點在多個物種中保守。隨后，研究者在OGT敲低的HCC細(xì)胞中分別構(gòu)建eEF1A1 T279A或CAPNS1 S88A突變。結(jié)果顯示，敲低OGT或eEF1A1 T279A均能導(dǎo)致HCC細(xì)胞O-糖基化水平的下降，同時呈現(xiàn)降低的生長速率、Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)以及克隆形成能力。相似地，CAPNS1 S88位的O-糖基化對細(xì)胞增殖也很重要。在果糖處理下，eEF1A1 T279A組的腫瘤生長和增殖也受到顯著抑制。這些結(jié)果表明，eEF1A1的O-糖基化對果糖誘導(dǎo)的HCC進展是關(guān)鍵的。

7. 在高果糖飲食小鼠中，腸道菌群乙酸鹽增強O-糖基化并且促進HCC進展

果糖通過腸道菌群轉(zhuǎn)化為乙酸鹽，而這種果糖來源的乙酸鹽可能促進UDP-GlcNAc合成和高的O-糖基化。因此，研究者繼續(xù)探索菌群乙酸鹽是否在體內(nèi)促進HCC進展。研究者通過廣譜抗生素清除HCC模型小鼠的腸道菌群。結(jié)果顯示，腸道菌群清除后，腫瘤組織中的谷氨酰胺、UDP-GlcNAc和O-糖基化顯著下降。eEF1A1的糖基化也被抑制。而在補充乙酸鹽后，中間代謝物、總O-糖基化和eEF1A1糖基化水平恢復(fù)。此外，補充乙酸鹽不影響腫瘤的數(shù)量但提高了肝臟和體重比、最大腫瘤大小以及絕對腫瘤負(fù)荷。補充乙酸鹽還導(dǎo)致PDOX模型小鼠腫瘤體積的增加。UDP-GlcNAc和O-糖基化水平也在補充乙酸鹽后上升。以上結(jié)果支持研究者的假設(shè)：高飲食果糖通過微生物乙酸鹽誘導(dǎo)的高O-糖基化促進HCC進展。

?小結(jié)

綜上所述，本研究在小鼠肝細(xì)胞癌模型中探索了高果糖促進肝癌進展的分子機制。結(jié)果顯示，果糖的腸道微菌群衍生物——乙酸鹽增強了腫瘤組織的O-GlcNAc糖基化，進而促進了肝癌進展。本研究為合理使用添加糖、防治代謝性疾病發(fā)生發(fā)展提供了重要的理論依據(jù)，并為相關(guān)疾病提供了潛在的治療靶點。

中科優(yōu)品推薦

本研究由表及里，循序漸進，是代謝組與O-GlcNAc糖基化聯(lián)合研究的經(jīng)典案例。O-GlcNAc糖基化作為一種重要的翻譯后修飾，其生物功能和作用機制已成為研究者關(guān)注的熱點方向。

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