分子克隆是最常見的分子生物學技術之一，也是現(xiàn)代生物技術的基礎。隨著技術的發(fā)展，目前分子克隆已經發(fā)展出了多種技術方法，以滿足不同的應用需求。

其中，TOPO克隆是一種非常簡單高效的克隆技術，能夠2-5min內快速完成插入片段和載體的連接反應，操作簡單，連接效率極高，克隆陽性率接近100%。

TOPO克隆技術的關鍵是DNA拓撲異構酶I，DNA拓撲異構酶I是由美國科學家StewartShuman在1990年從牛痘病毒中發(fā)現(xiàn)的，同時具有限制性內切酶活性和連接酶活性，它的生物學功能是在DNA復制過程中切斷并重新連接DNA。

牛痘病毒DNA拓撲異構酶I特異性地識別5’-(C/T)CCTT-3’序列，并與3'-T的磷酸基團形成共價鍵。在TOPO克隆中，TOPO載體被線性化，并在每個3'磷酸基團上連接了拓撲異構酶I，當遇到了有5‘羥基的插入片段（PCR產物）時，插入片段的5'端羥基會攻擊磷酸基團，并釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起，Topo異構酶從載體分子上脫落，完成連接反應（圖1）.

TOPO克隆的原理（圖1）

和TOPO克隆類似，T載體克隆同樣能夠將目的片段進行快速插入，但是相比于TOPO克隆，T載體克隆的方式有以下幾個缺點。

1.TOPO克隆既可以用于平末端也可以用于帶A尾的PCR產物，而T載體克隆只能連接帶A尾的PCR產物。

2.用T載體進行TA克隆的時候，通常需要將PCR反應產物進行純化后才能進行連接反應，而TOPO克隆可以直接對未經純化的PCR產物進行克隆，操作更加方便。

3.T載體克隆一般是12-16℃進行過夜連接，反應時間偏長，而TOPO克隆只需要在室溫（25℃）反應5 min即可。

TOPO克隆的應用場景非常廣泛,下面列舉兩種最為常見的應用：

1.在需要進行長片段或者一些復雜模板的載體構建的時候，可以先將插入片段亞克隆至TOPO載體上，將插入片段進行穩(wěn)定的保存，方便進行后續(xù)的分子操作。

2.需要對目的DNA片段進行一代測序時，也可以將目的DNA片段克隆至TOPO載體上，然后將插入有目的DNA片段的TOPO載體質粒送去測序，相對于PCR產物直接測序，送質粒測序結果更加準確，能夠測到序列更加完整。

RK30130--ABclonal Zero TOPO-TA/Blunt Cloning Kit是一款適合進行TOPO克隆實驗的試劑盒，本試劑盒載體含有自殺基因，只有當載體與插入片段連接成功，宿主細胞才能正常生長，從而實現(xiàn)零背景。

另外這款TOPO克隆試劑盒既能兼容帶A尾克隆，也能兼容平末端克隆，通用性非常好，同時TOPO載體很小，能夠容納更長的插入片段，最長可連接10kb。