腎結(jié)石病因復雜，受遺傳和環(huán)境因素影響，且在美國和世界各地的發(fā)病率正在上升。盡管幾十年的創(chuàng)新和研究人員努力描述其病理生理學，但對腎結(jié)石形成的確切機制仍然知之甚少，導致這種認識的關(guān)鍵因素缺陷是缺乏關(guān)于細胞和分子組成的數(shù)據(jù)。此外，結(jié)石疾病期間各種細胞類型的空間分布及其與礦物沉積的關(guān)系在很大程度上是未知的，這對于了解結(jié)石形成的發(fā)病機制極其重要。美國印第安納大學Tarek M. El-Achkar研究組、James C. Williams Jr.研究組以及?Michael T. Eadon研究組合作Nature Communications發(fā)文題為“A spatially anchored transcriptomic atlas of the human kidney papilla identifies significant immune injury in patients with stone disease”，通過對腎結(jié)石患者的腎乳頭進行空間轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出腎臟免疫損傷的具體分子細胞學特征。

?研究材料

腎臟組織

?技術(shù)路線

步驟1：腎乳頭細胞類型的識別和定位；

步驟2：腎乳頭內(nèi)CaOx結(jié)石形成的轉(zhuǎn)錄組學特征；

步驟3：礦化和非礦化組織的區(qū)域分析；

步驟4：大規(guī)模3D成像和組織細胞計數(shù)確定炎癥應激信號和巨噬細胞激活是結(jié)石病的主要特征；

步驟5：腎結(jié)石患者尿液中MMP7和MMP9水平升高，并與疾病活動性相關(guān)。

?研究結(jié)果

1. 腎乳頭細胞類型的識別和定位

從49個樣本中獲得280,053個snRNAseq圖譜，這些樣本跨越了新數(shù)據(jù)集(79,717個細胞核)和人類生物分子圖譜計劃(HubMap)和腎臟精密醫(yī)學項目(KPMP)數(shù)據(jù)集(200,336個細胞核)。利用該數(shù)據(jù)集來更深入地了解人類腎乳頭細胞類型的多樣性以及與皮質(zhì)髓質(zhì)細胞類型相比的獨特特征。除了預期的乳頭狀細胞類型，例如內(nèi)髓集合管的主細胞(PapPC)和閏細胞(IC)、乳頭狀表面上皮細胞和內(nèi)皮細胞，還鑒定出了相當數(shù)量的基質(zhì)細胞和免疫細胞。與皮質(zhì)和髓質(zhì)相比，乳頭中PapPC和成纖維細胞的比例最高。在乳頭狀和皮質(zhì)髓質(zhì)主細胞之間觀察到基因表達的顯著差異。除了健康的PapPC1群體外，還鑒定出富含應激/損傷基因的PapPC2群體。為了驗證這些細胞類型并確定它們在乳頭中的空間位置，使用了空間轉(zhuǎn)錄組學并結(jié)合snRNAseq數(shù)據(jù)，繪制了細胞分布圖譜。在組織中識別并繪制了PapPC1、PapPC2和未分化細胞的特征。PapPC1和PapPC2經(jīng)常共定位于相同的集合管，這表明PC的這些不同亞型在集合管中并未在空間上分離。利用snRNAseq差異表達分析的標記，使用smFISH來驗證這些獨特細胞類型的存在。與PapPC1細胞相比，集合管中的PapPC2細胞具有高MMP7和IGFBP7表達。未分化的細胞通常定位于間隙或小管，形態(tài)上與細肢一致。它們有IGFBP7的高表達，并且經(jīng)常共表達PROM1，這表明它們的退行性狀態(tài)發(fā)生了改變。

2. 腎乳頭內(nèi)CaOx結(jié)石形成的轉(zhuǎn)錄組學特征

接下來，使用snRNAseq的數(shù)據(jù)比較結(jié)石組織和參考組織細胞類型頻率和特定細胞類型基因表達的差異。結(jié)石中未分化細胞的比例顯著增加，結(jié)石中的多種細胞類型中損傷和應激基因表達水平升高，例如SPP1、CLU、LCN2、S100A11和MMP7。通路分析發(fā)現(xiàn)，在患有以下疾病的患者的細胞中，與蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的常見通路顯著富集。結(jié)石的ST顯示，未分化細胞經(jīng)常集中在礦化區(qū)域附近，可能是相鄰腎小管局部損傷的結(jié)果。并觀察到免疫、成纖維細胞和未分化細胞特征的增加以及腎小管細胞特征的伴隨減少。在snRNAseq中觀察到的損傷基因在ST結(jié)石樣品中相對ST參考組織中同樣高表達，富集通路與snRNAseq通路分析重疊。技術(shù)之間的一致結(jié)果增加了人們對這些途徑在結(jié)石病發(fā)病機制中的生物學相關(guān)性的信心。有趣的是，在結(jié)石患者中，MMP7顯示出彌漫性表達模式。使用共焦3D成像和組織細胞術(shù)對MMP7表達進行分析表明，具有高MMP7表達（可能對應于PapPC2）的集合管細胞的比例隨著結(jié)石病而增加?？偟膩碚f，該研究數(shù)據(jù)表明結(jié)石病將集合管和其他腎小管細胞的表型改變?yōu)閾p傷表型。這些變化可能會引發(fā)免疫和纖維化反應，最終取代健康的乳頭管狀上皮組成。

3. 礦化和非礦化組織的區(qū)域分析

礦物質(zhì)沉積，例如Randall斑塊(RP)的形成被認為在結(jié)石病的形成中發(fā)揮著重要作用。然而，斑塊形成通常是局灶性的，礦床微環(huán)境中存在的細胞和分子改變在這種疾病的發(fā)病機制中很重要。圖3顯示了礦化區(qū)域與非礦化區(qū)域的差異分析，結(jié)果表明，NEAT1、CHIT1、LYZ、SPP1和MMP9等基因在礦化區(qū)域中上調(diào)。使用CODEX成像在蛋白質(zhì)水平上也驗證了礦化區(qū)域中SPP1的高表達。

將CODEX多重成像與一組針對不同免疫細胞類型的抗體結(jié)合使用。利用了礦物沉積物的自發(fā)熒光特性，染色即可識別斑塊，在參考組織中識別出的主要細胞簇。對初始分析中的CD45+細胞簇進行了額外的無監(jiān)督分析，將免疫細胞分解為主要淋巴細胞和骨髓細胞簇。將免疫細胞返回到組織圖像顯示，斑塊沉積的某些區(qū)域充當免疫激活的巢穴，其中沉積的礦物質(zhì)被炎癥巨噬細胞（M1和M1/M2）包圍，免疫活性不增強的斑塊區(qū)域有顯著的成纖維細胞浸潤?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明斑塊的存在具有免疫原性。礦物質(zhì)沉積可能引發(fā)不同的免疫反應，從骨髓到混合淋巴細胞浸潤和非重疊的纖維化反應都有明確的進展。

4. 大規(guī)模3D成像和組織細胞計數(shù)確定炎癥應激信號和巨噬細胞激活是結(jié)石病的主要特征

接下來，想確定免疫激活和氧化損傷是否是CaOx結(jié)石患者乳頭的主要特征，與大量礦物質(zhì)沉積無關(guān)。使用定量大規(guī)模3D成像和組織細胞計數(shù)，對來自對照組和患有CaOx結(jié)石病且無可見礦物質(zhì)沉積的受試者（每組N=4）的乳頭組織標本進行定量。與對照組相比，CaOx結(jié)石患者的CD68+巨噬細胞豐度和氧化磷酸化的強度顯著升高。這與snRNAseq和轉(zhuǎn)錄組學分析的結(jié)果一致，表明結(jié)石患者乳頭中多種細胞類型的應激信號增加。

5. 腎結(jié)石患者尿液中MMP7和MMP9水平升高，并與疾病活動性相關(guān)

snRNAseq和ST數(shù)據(jù)集揭示了結(jié)石病患者乳頭中MMP7基因表達的上調(diào)以及礦化區(qū)域中MMP9基因表達的上調(diào)。接下來想知道它們的尿液分泌是否也可以篩查結(jié)石疾病活動。為此，作者對55名腎功能正?；颊叩哪蛞簶颖具M行了MMP7和MMP9檢測，將其分為3組：1）沒有已知結(jié)石臨床史的健康對照，2）非活性CaOx結(jié)石具有已知結(jié)石臨床病史但近期沒有結(jié)石事件的形成者，3)正在接受結(jié)石手術(shù)的活躍CaOx結(jié)石形成者。結(jié)果表明，與健康受試者相比，沒有活動性疾病的CaOx結(jié)石患者尿液中MMP7、MMP9的水平升高。在活動性結(jié)石形成者中，作者觀察到尿液MMP7、MMP9水平更高。這些結(jié)果表明MMP7和MMP9都是監(jiān)測結(jié)石病活動的潛在重要標記。

?小編小結(jié)

腎結(jié)石的發(fā)病率很高，并且會造成病人急性的痛楚。腎錐體組成腎乳頭結(jié)構(gòu)，草酸鈣沉積在腎乳頭中造成腎臟損傷。在該工作中，作者們通過對腎結(jié)石患者與健康受試者的腎乳頭細胞和分子生物學特征進行比較，發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石患者中存在更為普遍的上皮細胞未分化細胞類型。腎結(jié)石中礦物質(zhì)局部沉積會造成患者體內(nèi)廣泛的免疫激活、氧化應激以及炎癥反應等損傷特征，同時作者們確定基質(zhì)金屬蛋白酶MMP7和MMP9在腎結(jié)石患者尿液中明顯增加的分子特征?？偟膩碚f，該工作定義了人類腎乳頭結(jié)石損傷的空間分子特征并確定了尿液中的生物標記物。

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