2022年11月4日，復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院超聲科常才團隊聯(lián)合?bo Akademi大學Hongbo Zhang、腫瘤研究所唐爽團隊于Bioactive Materials (IF:16.874)在線發(fā)表了仿生納米顆粒在探究三陰乳腺癌中剪切波彈性硬度機制上的最新研究成果，提供了對乳腺癌SWE成像硬度機制的全面描述，以及基于SWE成像的新輔助治療效率預測模型。

期刊：Bioactive Materials

影響因子：16.874

發(fā)表年月：2022-11-04

材料：取6例小鼠的腫瘤組織進行單細胞測序

方法：10x Genomics單細胞3端測序

研究背景

乳腺癌的發(fā)病率逐年提高，2020年乳腺癌全球新發(fā)病例約230萬，是影響全球女性健康的首位高發(fā)癌癥。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)三陰性乳腺癌（TNBC）是一類侵襲性高、易復發(fā)轉(zhuǎn)移、異質(zhì)性強、缺少治療靶點的乳腺癌，約占全部乳腺癌的10-17%。大多數(shù)患者在臨床診斷為TNBC時已經(jīng)處于晚期階段。因此，開發(fā)一種臨床工具來預測患者對新輔助治療的敏感性以輔助臨床醫(yī)生制定治療方案非常重要。

腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs)是實體瘤的組成成分，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。有報道稱，乳腺癌中CAFs含量一定程度的影響剪切波彈性（SWE）硬度。SWE成像是超聲波敲擊不同彈性系數(shù)組織時產(chǎn)生不同剪切波的過程，其成像特征與腫瘤病理特征具有相關(guān)性。青蒿琥酯(Artesunate，ARS)是青蒿素的衍生物，具有良好的抗腫瘤潛力。將ARS與化療或免疫治療藥物聯(lián)用，同時干預CAFs和癌細胞，可能會獲得更好的治療效果。

近年來，納米醫(yī)學發(fā)展迅速，帶有腫瘤細胞膜的仿生納米顆粒已被廣泛應(yīng)用于提高納米藥物在體內(nèi)的循環(huán)和腫瘤靶向能力，已成為研究熱點。通過工程仿生納米顆粒增強ARS對腫瘤的抗纖維化作用，重塑TME，有助于我們更好地理解SWE硬度與CAFs之間的關(guān)系。

在本研究中，作者分析了233例患者的SWE圖像和病理指標，以及100例患者的乳腺癌組織。作者建立了初步的SWE預測模型，并制備了仿生納米顆粒，以闡明其決定腫瘤SWE成像硬度的機制。作者還使用單細胞測序技術(shù)進一步闡明了其機制，并驗證了研究結(jié)果?？傊?，作者提供了對乳腺癌SWE成像硬度機制的全面描述，以及基于SWE成像的新輔助治療效率預測模型。

研究結(jié)論

Result1 SWE影像學對TNBC患者的新輔助反應(yīng)效率的預測

作者對233例患者的病理指標和腫瘤SWE硬度進行分析，其中非TNBC的患者102例，TNBC的患者131例。首先，建立了由臨床病理醫(yī)師對病理指標Ki67和CD8評分系統(tǒng)。過SWE成像測量了腫瘤硬度，分析腫瘤硬度值與病理評分( Ki67評分+ CD8評分)的相關(guān)性。與非TNBC相比，TNBC具有更高的腫瘤硬度( p < 0.0001 )和Ki67表達( p < 0.0001 )，以及更低的CD8浸潤( p < 0.01 )?；谖墨I報道，作者選擇將α-SMA作為CAF標志物。隨后，對50例TNBC的患者和50例非TNBC患者的癌組織樣本進行α - SMA染色，以評估它們之間的纖維化程度。結(jié)果表明，TNBC腫瘤確實比非TNBC腫瘤具有更高的纖維化。腫瘤硬度與新輔助治療的緩解率有很強的相關(guān)性，R平方為0.811，p = 0.0000113，證明這種相關(guān)性具有很好的可靠性。以上結(jié)果表明SWE成像在預測新輔助治療上具有良好潛力。

Result2 仿生納米粒子的表征

作者設(shè)計了細胞膜修飾的納米粒( 231M-NPs 和 E0771M-NPs )來改善ARS在不同小鼠腫瘤模型中的蓄積。首先，作者驗證了納米顆粒具有良好的同源靶向能力和同源靶向作用；進一步，量化了細胞內(nèi)吞的仿生納米顆粒的數(shù)量，描繪了細胞邊緣并量化了細胞中的光強度。通過場發(fā)射透射電子顯微鏡( FETEM )成像顯示231M - ARS @ PLGA納米粒( 231M-AP NPs)呈球形，直徑約150 nm 。多分散指數(shù)( PDI )也表明納米粒具有良好的粒徑均一性。穩(wěn)定性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米粒子在200 ~ 300nm之間均一性較好，當細胞膜：納米粒子重量比為1：1時，仿生納米粒子均一性和穩(wěn)定性較好。對231M - NPs的元素分析顯示納米顆粒上存在磷和氧元素，證明膜成功修飾在納米顆粒上。

Result3 體外ARS介導的成纖維細胞抑制作用

作者對6株人乳腺癌細胞系( MDA - MB - 231、MDA - MB - 468、SK - BR - 3、AU565、MCF - 7、T - 47D)、1株小鼠TNBC細胞系( E0771 )和3株成纖維細胞( CAFs、L929、HMEC)進行了CCK - 8實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，231M-APNPs、ARS、AP NPs無明顯細胞毒性，推測在實體瘤中的抗腫瘤作用是由于其抗纖維化作用。隨后，為了驗證ARS的抗纖維化作用，作者利用免疫熒光和western blot實驗在細胞水平評估了ARS的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用231M - APNPs處理成纖維細胞后，Vimentin和α - SMA表達顯著下降，231M-AP NPs與納米粒共孵育后抑制CAF相關(guān)蛋白的表達。以上實驗結(jié)果表明，ARS對CAFs具有抑制性。

Result4 青蒿琥酯的體內(nèi)抗腫瘤作用

作者將MDA - MB - 231異種移植瘤( n = 40)小鼠隨機分為4組：對照組、ARS組、AP NPs組和231M - AP NPs組。ARS組和231M - AP NPs組在治療27天后僅表現(xiàn)出微弱的抗腫瘤作用，231M-AP NPs表現(xiàn)出比ARS更低的副作用。第25天，采用SWE成像對各組腫瘤進行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩組腫瘤大小沒有統(tǒng)計學差異的情況下，231M-AP NPs和ARS組腫瘤硬度低于對照組和AP NPs組，說明抑制CAFs功能能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤硬度。作者還驗證出ARS和231M - AP納米粒可以抑制CAF功能從而改變腫瘤微環(huán)境。隨之，作者對所有腫瘤樣本的免疫熒光切片進行染色，并使用Image J對HIF - 1 α和α - SMA對應(yīng)的熒光強度進行量化。HIF - 1 α和α - SMA在ARS和231M - AP NPs組中顯著下調(diào)。與其他組相比，231M-AP NPs組肝臟炎癥程度相對較輕。以上結(jié)果表明，231M-AP NPs組在逆轉(zhuǎn)腫瘤硬度和重塑TME方面比ARS組具有更好的效果，這說明仿生納米粒具有更好的藥物遞送能力。在接下來的實驗中，仿生納米顆粒將幫助我們更明顯地比較抑制CAFs功能所引起的SWE成像變化。

Result5 體內(nèi)青蒿琥酯介導的化療增敏

作者設(shè)計了231M - ARS / PTX @ PLGA納米粒( 231M- APP NPs)來驗證TME重塑是否可以放大化療藥物的抗腫瘤作用這一假設(shè)。結(jié)果表明，ARS與PTX聯(lián)用比單獨使用PTX具有更好的抗腫瘤效果，且ARS可以放大PTX的抗腫瘤效果，抗腫瘤效果與孵育時間呈正相關(guān)。隨后，作者將40只MDA - MB - 231移植瘤小鼠隨機分為4組：對照組、PTX組、PTX + ARS組和231M - APP NPs組，治療21天后，PTX + ARS組和231M - APP NPs組均表現(xiàn)出良好的治療效果，尤其是231M - APP NPs組；作者還發(fā)現(xiàn)231M - APP NPs誘導的副作用比純藥物組合更小。

Result6 體內(nèi)E0771M - AP NPs介導的免疫治療增敏作用

作者將60只C57 / B6J小鼠隨機分為6組：對照組、ARS組、PD1組、PD1 + ARS組、E0771M - AP NPs組和PD1 + E0771M-AP NPs組。治療18天后，與PD1、PD1 + ARS和E0771M - AP NPs組相比，PD1 + E0771M-AP NPs組表現(xiàn)出顯著的治療效果。此外，與直接用藥物( ARS ) 處理的小鼠相比，用仿生納米藥物( E0771M-AP NPs)處理的小鼠的毒性較低。由于裸鼠不具有健全的免疫功能，不能完全模擬人實體瘤的腫瘤微環(huán)境，為了更真實的評估腫瘤硬度來部分源于CAFs的功能狀態(tài)。然后作者對腫瘤進行了SWE成像，驗證了SWE成像硬度是由腫瘤的纖維化程度和CAFs的功能狀態(tài)共同決定的。對E0771M - AP NPs緩解TME缺氧的機制的研究發(fā)現(xiàn)，用ARS或E0771M - AP NPs治療的腫瘤在腫瘤中顯示出血氧增加的趨勢。PD1抑制劑激活脾臟產(chǎn)生更多的T細胞，E0771M-AP NPs聯(lián)合PD1抑制劑能募集更多的CD8 + T細胞進入腫瘤，使血液中CD8 + T細胞的百分比略有下降。定量結(jié)果顯示，E0771M-AP NPs增加了腫瘤中CD8 + T細胞的浸潤。腫瘤組織TUNEL免疫組化分析顯示E0771M-AP NPs可抑制腫瘤增殖。此外，免疫組化顯示經(jīng)ARS或仿生納米顆粒處理的腫瘤中Ki67表達也降低。

Result7 仿生納米顆粒在體內(nèi)的分布

作者將吲哚菁綠( ICG )的衍生物Cypate裝載到納米粒中，并設(shè)置了7個濃度梯度( 200、100、50、20、10、5和0微克/毫升)，觀察NP濃度與熒光強度的關(guān)系。經(jīng)尾靜脈注射后，觀察納米顆粒在小鼠體內(nèi)的代謝行為。與未修飾的納米顆粒相比，負載Cypate的E0771MNPs表現(xiàn)出更明顯的腫瘤靶向效果。腫瘤的熒光曲線顯示，隨著循環(huán)時間的延長，納米藥物在腫瘤中的蓄積量逐漸增加；且E0771M - NPs組與NPs組相比差異顯著。在6 h時，E0771M - NPs仍有腫瘤蓄積，但大部分滯留在肝臟、脾臟和腎臟。為了進一步檢測納米顆粒在腫瘤內(nèi)的蓄積情況，作者使用負載染料的納米顆粒，在尾靜脈注射后的第1小時和第4小時獲取腫瘤切片。在注射后的第1小時，大部分的納米顆粒殘留在血管中，但在注射后的第4小時，更多的納米顆粒聚集在腫瘤間質(zhì)中。納米顆粒大多通過內(nèi)皮細胞的內(nèi)吞作用進入實體瘤；完成跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運幾乎需要4 h，這先前的報道是一致的。

Result8 單細胞測序確定CAFs影響SWE硬度的機制

為了探索腫瘤SWE硬度與CAFs之間的關(guān)系，作者從Control、PD1和PD1 + E0771M-AP NPs組中各選取2只小鼠，對每個腫瘤進行了單細胞測序。將細胞分為17組，根據(jù)特定的Maker基因?qū)⑺屑毎譃?2個cluster，細胞類型主要為：T細胞、巨噬細胞、上皮細胞、CAFs、自然殺傷細胞( NK )、血管內(nèi)皮細胞( vEC )、樹突狀細胞( DC )、中性粒細胞、平滑肌細胞( SMC )、B細胞、漿細胞和肥大細胞。與其他兩組相比，PD1 + E0771M-AP NPs組血管內(nèi)皮細胞( vECs )增加。通過Maker基因( Mmp2、Apod、Dcn和Col1a1)在所有細胞中鑒定出癌癥相關(guān)的成纖維細胞。CAF細胞按基因表達進行聚類，分為9個cluster。隨后，作者觀察了每種CAFs的所有表達基因中可富集到這些通路的基因數(shù)目，以評估這些通路與不同類型CAFs之間的關(guān)聯(lián)。ECM CAFs和傷口愈合CAFs主要影響細胞外基質(zhì)合成，進一步證實了腫瘤硬度與CAFs的含量和功能狀態(tài)有關(guān)。

此外，作者還對T細胞、巨噬細胞和vEC進行分析鑒定，以研究E0771M - AP NPs對TME重塑的影響。將T細胞劃分為10種cluster，E0771M-AP NPs增強了腫瘤中CD8 +記憶性T細胞的浸潤。為了在多個維度評估TME重塑，評估了6個巨噬細胞簇的巨噬細胞極化評分。與對照組相比，PD1組和PD1 + E0771M-AP NPs組的M1型巨噬細胞比例增加。通過對血管內(nèi)皮細胞( vEC )的鑒定分析，發(fā)現(xiàn)ARS增加了炎性EC的比例。因此可以假設(shè)含有炎性內(nèi)皮細胞的血管能夠促進免疫細胞滲入腫瘤并增加血氧供應(yīng)，以減輕缺氧問題。綜上所述，通過單細胞測序，證明了E0771M - AP NPs可以重塑TME，腫瘤SWE硬度與CAFs的功能狀態(tài)密切相關(guān)。

Result9 基因通路的GO富集分析

為了明確E0771M - AP NPs逆轉(zhuǎn)腫瘤SWE成像硬度和減輕TME缺氧的具體通路，作者對PD1組和PD1 + E0771M-AP NPs組CAFs進行差異基因富集分析，分析比較了兩組CAFs的基因，篩選了差異基因，并進一步分析了兩組間血管內(nèi)皮細胞中的差異基因。通過上述分析進行GO富集分析，各組CAFs的通路變化主要集中在細胞外基質(zhì)。E0771M-AP NPs可通過抑制CAFs功能減少細胞外基質(zhì)和膠原分泌。PD1 + E0771M-AP NPs組含膠原細胞外基質(zhì)通路相關(guān)基因集高于PD1組，表明E0771M - AP NPs主要影響該通路。而PD1 + E0771M-AP NPs組腫瘤內(nèi)的氧運輸和對自然殺傷細胞趨化性的正向調(diào)節(jié)增強，再次證實了腫瘤SWE成像硬度受到CAFs分泌的細胞外基質(zhì)的影響。

作者進一步分析了兩組間血管內(nèi)皮細胞中的差異基因，發(fā)現(xiàn)重塑腫瘤微環(huán)境后，血管內(nèi)皮細胞的氧轉(zhuǎn)運能力以及對血紅蛋白復合物的親和力和氧載體活性均增強，有效減輕了腫瘤細胞的缺氧問題。傷口愈合CAFs與nfkb1相關(guān)性更高，介導腫瘤慢性炎癥的發(fā)生，促進腫瘤的侵襲和生長。Xbp1、hivep3、lrf8、lrf2、elf1分別是ECM CAFs和傷口愈合CAFs中最高的調(diào)控特異性評分( RSS )。此外，這些調(diào)控子均與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。我們推測這兩種CAFs亞型在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

通過細胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)PD1 + E0771M-AP NPs組的ECM CAFs、傷口愈合CAFs和腫瘤血管之間的聯(lián)系被顯著阻斷。相反，在PD1 + E0771M-AP NPs組中，炎癥血管與CD8 +記憶T細胞之間的聯(lián)系顯著增強。以上結(jié)果表明，這兩種亞型的CAFs與腫瘤增殖和免疫抑制密切相關(guān)。

文章總結(jié)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，開發(fā)一種臨床工具來預測患者對新輔助治療的敏感性以輔助臨床醫(yī)生制定治療方案非常重要。臨床實踐結(jié)果證明，三陰乳腺癌（TNBC）患者具有更高的剪切波彈性（SWE）硬度，而且TNBC組織中α-SMA的表達高于非TNBC組織。此外，SWE硬度與新輔助治療反應(yīng)效率也表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。為了解釋這一現(xiàn)象，制備了TNBC細胞膜修飾的聚乳酸-羥基乙酸( PLGA )納米粒子，通過抑制CAFs的功能狀態(tài)，特異性地傳遞青蒿琥酯來調(diào)節(jié)SWE的硬度。在MDA - MB - 231和E0771原位腫瘤模型中，231M - ARS @ PLGA納米粒( 231M-AP NPs)抑制了CAFs功能狀態(tài)，進一步降低了腫瘤的SWE硬度，并減弱了腫瘤的缺氧，增強了紫杉醇和PD1抑制劑的抗腫瘤作用。

單細胞測序結(jié)果表明，產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的兩種主要CAFs亞型（ECM CAFs和Wound healing CAFs）能夠影響腫瘤SWE硬度和藥物的抗腫瘤作用。此外，仿生納米顆粒抑制CAFs功能可通過增加炎性血管比例和氧轉(zhuǎn)運能力來減輕腫瘤缺氧。因此，作者的發(fā)現(xiàn)對于理解CAFs對影響SWE硬度和藥物抗腫瘤作用的作用具有基礎(chǔ)意義，這為未來可以通過對SWE成像的無創(chuàng)分析，進一步暗示其對新輔助治療療效的潛在臨床治療預測具有意義。

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(單細胞測序）

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