外周血單細(xì)胞懸液制備流程
1.采集人外周血樣本于抗凝管中。
離心管內(nèi)加入100 μL新鮮血和2 mL 1×紅細(xì)胞裂解液，混勻，4℃裂解10 min。
300 g離心5 min（裂解完立即離心，防止時(shí)間過長損傷細(xì)胞），棄上清，得到白色細(xì)胞沉淀。
PBS洗滌一次。
加入100 μL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，不用計(jì)數(shù)，即可進(jìn)行后續(xù)流式抗體染色實(shí)驗(yàn)。按照100 μL新鮮血樣本制備的單細(xì)胞懸液，加入1 Test對(duì)應(yīng)的流式抗體混勻進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)：
1.?采血用抗凝管，有肝素和EDTA兩種。若直接裂解紅細(xì)胞進(jìn)行表面指標(biāo)染色實(shí)驗(yàn)，兩種抗凝管都可使用；如果是采血后檢測細(xì)胞因子，則必須使用肝素抗凝。
2.?裂解液推薦使用10× ACK Lysis Buffer（E-CK-A105），不含固定劑。
3.10× ACK Lysis Buffer實(shí)驗(yàn)前需用純水稀釋成1×，現(xiàn)配現(xiàn)用，推薦放在4℃條件下暫存，當(dāng)天使用。
4.?檢測人外周血中常規(guī)指標(biāo)，可用過夜保存的樣本，一般來說問題不大。但是對(duì)于表達(dá)量比較低的指標(biāo)，建議用新鮮的樣本檢測。
5.?第三步裂解完后離心棄上清時(shí)，建議用移液槍輕輕吸走殘液。如果直接倒掉，離心管內(nèi)會(huì)有殘留裂解液，后續(xù)加入100 μL PBS重懸細(xì)胞時(shí)，可能不能完全稀釋裂解液，導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解過度。
6.?細(xì)胞沉淀重懸，可用槍輕輕吹打，或者用轉(zhuǎn)速小的渦旋儀渦旋。
7.?人血樣本建議染CD45，有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析時(shí)圈門。
8.?處理人血樣本時(shí)，推薦設(shè)置只染CD45的單染管低速上機(jī)用來設(shè)置閾值，觀察細(xì)胞量，圈淋巴細(xì)胞群。
9.?人外周血中主要含T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞的量較少。如果使用病人的血液樣本，B淋巴細(xì)胞的量可能更少，因此B淋巴細(xì)胞的檢測不推薦使用過夜的樣本，過夜樣本易導(dǎo)致檢測信號(hào)低。