Jackson公司熒光免疫印跡前言：

熒光蛋白質(zhì)印跡可以為已經(jīng)很強(qiáng)大的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)提供許多優(yōu)勢(shì)。二抗與熒光染料（如?Alexa Fluor ??）偶聯(lián)， 產(chǎn)生可使用數(shù)字成像儀檢測(cè)的信號(hào)。該技術(shù)靈敏度高，可定量使用，無(wú)需剝離和重新探測(cè)即可在同一印跡上進(jìn)行多重檢測(cè)。

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與比色法和化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡法一樣，熒光蛋白質(zhì)印跡法使用抗原-抗體復(fù)合物來(lái)檢測(cè)通過(guò)電泳分離后固定在印跡膜上的特定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的可視化是通過(guò)使用配備適當(dāng)光源的成像系統(tǒng)激發(fā)熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)的。熒光染料在其激發(fā)波長(zhǎng)處吸收光，然后在其發(fā)射波長(zhǎng)處釋放光子，使分子返回其基電子態(tài)。然后由配備正確濾光片的數(shù)字成像儀檢測(cè)熒光分子（熒光團(tuán)）發(fā)出的光。

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Jackson公司：與化學(xué)發(fā)光和比色檢測(cè)相比，熒光蛋白質(zhì)印跡具有許多優(yōu)勢(shì)。

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Jackson公司：多重檢測(cè)——在一次印跡上檢測(cè)多種蛋白質(zhì)

熒光印跡使多重蛋白質(zhì)印跡分析變得容易實(shí)現(xiàn)，?因?yàn)?可以在同一個(gè)印跡上同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分多種蛋白質(zhì)。針對(duì)在不同物種中產(chǎn)生的一抗的染料偶聯(lián)二抗可用于標(biāo)記每種特定抗原?（蛋白質(zhì)）具有其自身發(fā)射波長(zhǎng)的染料——光譜特性。光譜上不同的染料被數(shù)字成像儀激發(fā)并以其特征波長(zhǎng)發(fā)光，從而允許在同一個(gè)印跡上檢測(cè)到兩種或三種不同的蛋白質(zhì)（圖?2）。這提供了優(yōu)于化學(xué)發(fā)光和比色檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，化學(xué)發(fā)光和比色檢測(cè)在查看多個(gè)目標(biāo)時(shí)需要?jiǎng)冸x和重新探測(cè)印跡。熒光檢測(cè)允許定量使用印跡，因?yàn)橛≯E上的蛋白質(zhì)不受刺激性剝離化學(xué)品的干擾。另一個(gè)好處是通過(guò)電泳分辨不好的蛋白質(zhì)的可視化，因?yàn)椴荒芎芎玫胤蛛x大小的蛋白質(zhì)可以通過(guò)顏色來(lái)區(qū)分。

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定量的

產(chǎn)生的信號(hào)量與存在的蛋白質(zhì)量成正比。當(dāng)與寬動(dòng)態(tài)范圍相結(jié)合時(shí)，可以定量使用優(yōu)化的熒光蛋白質(zhì)印跡，因?yàn)榭梢栽谕粋€(gè)印跡上檢測(cè)低豐度和高豐度蛋白質(zhì)而無(wú)需飽和檢測(cè)。

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Jackson公司：靈敏度和魯棒性

Alexa Fluor ? 680?和?790（圖?2）等遠(yuǎn)紅和紅外熒光染料偶聯(lián)物由于低熒光猝滅、高消光系數(shù)和低背景自發(fā)熒光而提供更高的靈敏度。它們可用于高靈敏度、定量和凝膠內(nèi)?Western?印跡以及?microWestern、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)?Western?陣列以及其他需要最亮染料的技術(shù)。由于良好的穩(wěn)定性，印跡可能會(huì)被存檔和重新成像。

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Jackson公司：熒光斑點(diǎn)印跡

一種非常簡(jiǎn)單和快速的免疫技術(shù)，可用于優(yōu)化檢測(cè)限和篩選大量樣品是斑點(diǎn)印跡。當(dāng)分析物的遷移已經(jīng)被表征時(shí)，斑點(diǎn)印跡是一種快速而簡(jiǎn)單的方法來(lái)篩選多個(gè)樣品中是否存在感興趣的蛋白質(zhì)。網(wǎng)格系統(tǒng)的使用可以確定檢測(cè)靈敏度，而無(wú)需在多個(gè)蛋白質(zhì)印跡中轉(zhuǎn)移的可變性。使用熒光染料可以在同一印跡上確認(rèn)樣品中存在一種或多種分析物。

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注意：與化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡法一樣，熒光印跡法需要優(yōu)化以改善對(duì)背景噪聲信號(hào)的檢測(cè)。背景可能來(lái)自用于印跡的材料，因此選擇不具有熒光特性的材料很重要。聚丙烯酰胺電泳凝膠和印跡膜（硝酸纖維素和?PVDF）可能具有熒光特性，可導(dǎo)致顯著背景。使用檢測(cè)儀器上可用的各種過(guò)濾器選項(xiàng)觀察未染色的凝膠或膜，如果可能，選擇在膜不自發(fā)熒光的區(qū)域發(fā)光的熒光染料。

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低信號(hào)可能是由于低抗原（由于低蛋白表達(dá)、降解或印跡膜過(guò)度清洗），并且隨后的熒光標(biāo)記將低，即使二抗具有放大優(yōu)勢(shì)。信號(hào)也可以由于熒光猝滅而降低，如果熒光標(biāo)記太高，信號(hào)會(huì)因?F?rster?共振能量轉(zhuǎn)移?(FRET)?而減弱。與化學(xué)發(fā)光印跡相比，數(shù)字成像儀可以有效優(yōu)化檢測(cè)條件，化學(xué)發(fā)光印跡需要反復(fù)曝光才能優(yōu)化。

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備注：

圖1：間接熒光檢測(cè)。A.?熒光染料偶聯(lián)二抗可檢測(cè)目的蛋白的一抗。B.?光用于在其激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)熒光偶聯(lián)物。C.?激發(fā)的熒光染料在其發(fā)射波長(zhǎng)處發(fā)射光，通過(guò)數(shù)字成像儀檢測(cè)到該光，從而使感興趣的蛋白質(zhì)可視化。

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圖2：無(wú)需剝離和重新探測(cè)即可對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)進(jìn)行多重檢測(cè)。使用?Alexa Fluor ? 680?遠(yuǎn)紅染料和?Alexa Fluor ? 790?紅外染料對(duì)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行雙重免疫熒光染色。小鼠?IgG?用 β-巰基乙醇和?SDS?還原和變性。重鏈和輕鏈通過(guò)?SDS-PAGE?分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，并用?1:100,000?稀釋的?Alexa Fluor? 790-山羊抗小鼠?IgG、Fcγ 亞類?1?特異性（min X Hu、Bov、Rb Sr Prot, 115-655-205)（綠色）檢測(cè)?50 kDa?重鏈和?1:100,000?稀釋的?Alexa Fluor?680-山羊抗小鼠?IgG，輕鏈特異性（min X Bov、Gt、Hrs、Hu、Rb、Rat、Shp Ig、115-625-174）（紅色）檢測(cè)?25 kDa?的輕鏈）。熒光在?LiCor Odyssey?成像儀中成像。

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圖?3：熒光點(diǎn)印跡。使用?Alexa Fluor ? 488 Goat anti-Rabbit IgG (H +L)?檢測(cè)到?ChromPure Rabbit IgG ( H+L)。應(yīng)用蛋白質(zhì)后，使用?5%?牛血清白蛋白封閉膜。1秒曝光；過(guò)濾器?525;?藍(lán)色LED模組燈；3×3?分箱。

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表?1：根據(jù)您的數(shù)字成像儀的設(shè)置，從紫外到紅外的熒光染料可能兼容用于熒光蛋白質(zhì)印跡。對(duì)于多重檢測(cè)，重要的是選擇光譜不同且沒(méi)有重疊光譜的染料。

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Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)領(lǐng)域覆蓋各大學(xué)科研所和醫(yī)院里的動(dòng)物研究以及生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)的科學(xué)家。艾美捷科技是Jackson公司的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。