第11章 核酸性質(zhì)及研究方法

名詞、符合、結(jié)構(gòu)

DNase：脫氧核糖核酸酶，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。

RNase：核糖核酸酶，RNA水解酶，RNase H是一種核糖核酸內(nèi)切酶，能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。RNase A 對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用。

? ? 限制修飾系統(tǒng)：在細胞中，限制酶可降解外源侵入的DNA，但不降解經(jīng)修飾酶甲基化保護的自身DNA,此為限制修飾系統(tǒng)。主要由限制內(nèi)切酶和甲基化酶組成的二元系統(tǒng)。

?Tm：DNA的熱變性過程中光吸收達到最大吸收一半時的溫度稱為DNA的解鏈溫度( melting temperature，簡寫Tm)或熔點

Southern-blot：? Southern blot印跡法利用已知的DNA探針檢測靶標DNA的存在及大小位置，Southern印跡法就是將電泳凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上后，再進行雜交。

Northern-blot? 利用DNA或RNA探針將RNA變性后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上再進行雜交。檢測靶RNA的存在。

?EB：溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。

?PCR：聚合酶鏈反應體外擴增DNA技術，?

ddGTP：雙脫氧腺嘌呤核苷三磷酸。

簡答題

影響Tm的因素有哪些？

答：DNA的均一性、G-C之含量、介質(zhì)中的離子濃度。

影響質(zhì)粒電泳行為的因素有哪些。

答：DNA分子的大小、膠濃度、電壓、電極緩沖液、溫度、堿基組成、溴化乙錠。

DNA雙脫氧測序的原理

雙脫氧測序原理，末端終止法—

答：聚合酶用模板作指導，不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準確信息，從而將全部C的位置確定下來。類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結(jié)尾的三組長短不一的片段。將制得的四組混合物平行地點加在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳板上進行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，制得相應的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列.

分子雜交技術的原理及應用。

答：應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì)，使兩條來源不同的具有一定同源性（即具有堿基互補關系）的單鏈DNA分子或單鏈DNA分子與RNA分子經(jīng)退火形成雙鏈DNA分子或DNA-RNA異質(zhì)雙鏈分子(heteroduplex)的過程。三大分子雜交技術

Southern blotting

Northern blotting

Western? blotting-- Western Blotting利用抗原抗體之間互補性結(jié)合的原理，利用酶連或其它方式標記的抗體檢測靶抗原的存在及存在部位。

Southern blotting 和Northern blotting利用同源單鏈核酸分子可依據(jù)堿基配對原則形成異質(zhì)雙鏈的原理，通過放射性或非放射性方法標記一段單鏈核酸序列獲得探針，檢測與探針同源的核酸分子的研究方法。

DNA復雜度與復性速度之間的關系。

答：DNA的片段越大，復性速度越小，具有的重復序列越多福星速度越快。

核酸純度鑒定方法？核酸分子均一性的鑒定方法？

答：測定OD260：OD280的比值來表示DNA的純度

PCR技術的基本原理，關鍵步驟及應用。

答：原理：高溫可以使DNA的雙鏈解離形成單鏈，再通過引物與DNA模板結(jié)合，之后在TaqDNA聚合酶催化下DNA鏈延伸，合成與模板互補的子鏈，最終形成新的DNA。

基本步驟：設計一對引物以便有效擴增所需的DNA序列，并盡可能減少產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物；選擇三個溫度進行熱循環(huán)：變性（使DNA雙鏈解離形成單鏈）、退火（低溫下引物與模板DNA互補區(qū)結(jié)合）、延伸（中溫下，在DNA酶的催化下以引物為起點的DNA鏈的延伸。）；擴增完成后取出一定產(chǎn)物，檢測擴增結(jié)果。

應用：病原體的檢測、法醫(yī)和刑偵鑒定、癌基因的檢查、基因探針的制備、基因組測序和染色體巡視、cDNA庫的構(gòu)建、基因突變的分析和定位誘變、DNA重組、基因的分離和克隆、遺傳病和某些疑難病的診斷以及孕婦的產(chǎn)前檢查。

1、模板DNA 2、寡核苷酸引物 3、dNTP 4、Taq 5、緩沖環(huán)境、合適的溫度

Southern blot 的基本流程。

答：將DNA樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶降解后，用瓊脂糖凝膠電泳進行分離。將膠浸泡在堿（NaOH）溶液中使DNA進行變形，然后將變性轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上（硝酸纖維素膜只吸附變性DNA），在80攝氏度焙烤4~6小時，使DNA牢固地吸附在硝酸纖維素膜上。然后與放射性同位素標記的變性DNA探針進行雜交。雜交需在較高的鹽濃度及適當?shù)臏囟龋ㄒ话?8）下進行數(shù)小時或十余小時。然后通過洗滌，除去未雜交上的標記物。將硝酸纖維素膜烘干后進行放射自顯影。