「青蓮客戶文獻(xiàn)」宏蛋白組組學(xué)技術(shù)用于脲酶蛋白多樣性研究

? ? ? ?2020年9月18號， 來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的團(tuán)隊(duì)在Frontiers in Microbiology期刊上在線發(fā)表了題為“Pipeline for Targeted Meta-Proteomic Analyses to Assess the Diversity of Cattle Rumen Microbial Urease”的研究論文，該研究開發(fā)了一種有針對性的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法來分析瘤胃脲酶蛋白的多樣性。包括前處理中對蛋白質(zhì)提取（液氮冷凍研磨時(shí)間）、蛋白質(zhì)消化狀態(tài)（溶液中或凝膠中）以及所用消化酶（胰蛋白酶或Glu-C/Lys-C）進(jìn)行了優(yōu)化，并通過LC-MS/MS對酶解后的多肽進(jìn)行分析（青蓮百奧提供技術(shù)支持）。該方法為在其他生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行有針對性的宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了指南。

取樣策略

? ? ? ?使用瘤胃插管從3頭牛身上收集瘤胃食糜樣品，并通過四層紗布過濾以分離瘤胃液。

研究思路

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

? ? ? ?冷凍研磨對蛋白質(zhì)濃度和脲酶活性的影響

? ? ? ?為了評估冷凍研磨方法在蛋白質(zhì)提取中的適用性，評估了冷凍研磨持續(xù)時(shí)間對脲酶活性和蛋白質(zhì)濃度的影響。?結(jié)果表明，與冷凍研磨3或5分鐘相比，在液氮中冷凍研磨4分鐘可使脲酶活性（955.73?nmol/min/mg）和蛋白質(zhì)濃度（137.73μg/mL）最大化（圖1）。

不同消化方法對瘤胃微生物脲酶宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析的影響

? ? ? ?評估了四種不同的消化方法（胰蛋白酶溶液酶切、胰蛋白酶膠內(nèi)酶切、Glu-C/LysC溶液酶切和Glu-C/Lys-C膠內(nèi)酶切），以選擇瘤胃微生物脲酶宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析的最佳方法。采用Peaks軟件對不同方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，圖2A顯示了四種不同消化方法的實(shí)際鑒定結(jié)果。胰蛋白酶膠內(nèi)酶切優(yōu)于其他消化方法，在肽段譜圖匹配數(shù)(PSM)、匹配到數(shù)據(jù)庫的肽段數(shù)和非數(shù)據(jù)庫肽段數(shù)、蛋白鑒定數(shù)量均最多。該方法比其他方法至少多了37.72%的肽段（來自數(shù)據(jù)庫）和103.07%的蛋白檢出率。此外，胰酶膠內(nèi)酶切也檢測到最多的獨(dú)有肽段（來自數(shù)據(jù)庫）和蛋白質(zhì)，分別為38%和42%（圖2B，C）。對于MS/MS掃描（二級譜圖數(shù)），無論是溶液酶切還是膠內(nèi)酶切，Glu-C/Lys-C消化表現(xiàn)出比胰蛋白酶消化略好的性能。

瘤胃微生物脲酶多樣性

? ? ? ?采用胰酶膠內(nèi)酶切的方法，在多肽和蛋白質(zhì)水平上研究瘤胃微生物脲酶的多樣性。共從數(shù)據(jù)庫中鑒定到2720個(gè)肽段，132個(gè)蛋白；非數(shù)據(jù)庫的肽共鑒定出4008個(gè)。鑒定到的蛋白質(zhì)分別來自海洋原綠球菌（Prochlorococcus marinus）、海爾曼螺桿菌（Helicobacter heilmannii）、Thalassobacillus devorans、芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus sp. THM7-4）、纖維化纖維菌（Cellulosimicrobium cellulans）、嗜冷芽孢八疊球菌（Sporosarcina psychrophila）和一些未知菌。這些數(shù)據(jù)表明瘤胃微生物脲酶的蛋白質(zhì)多樣性。此外，在多肽水平上，59.57%的多肽是非數(shù)據(jù)庫來源的（圖3A），表明瘤胃中存在許多未知的微生物脲酶。

小結(jié)

? ? ? ?為了分析瘤胃微生物脲酶的多樣性，該研究開發(fā)了一種結(jié)合高脲酶活性的蛋白提取和胰蛋白酶消化凝膠內(nèi)蛋白的有針對性的宏蛋白組學(xué)分析方法。脲酶蛋白具有較高的多樣性，這些蛋白主要來自原綠球菌（Prochlorococcus）、螺桿菌（Helicobacter）和一些不可培養(yǎng)的細(xì)菌。該方法不僅擴(kuò)展了對牛瘤胃中高活性脲酶的理解，也為在其他復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行有針對性的宏蛋白質(zhì)組分析提供了指導(dǎo)。

用于評估牛瘤胃微生物脲酶多樣性的宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法

期刊名稱：Frontiers in Microbiology

影響因子：4.235

樣本選擇：牛瘤胃液樣本

技術(shù)策略：LC-MS/MS

搜庫軟件：Peaks（可實(shí)現(xiàn)非數(shù)據(jù)庫來源的肽段檢索）

? ? ? ?青蓮百奧可提供一站式蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、多組學(xué)聯(lián)合分析等科研服務(wù)。青蓮百奧在生物活性肽檢測項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)豐富，界內(nèi)最全的Bioactive Database、NeuroPedia Database，專業(yè)分析軟件Peaks，海歸坐鎮(zhèn)生信分析團(tuán)隊(duì)，助您在科研道路上乘風(fēng)破浪，沖擊高水平文章。

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